紅杜仲的美白活性及其途徑研究

林錦彬，任桐，連一江，李偉杰，金鑫，夏智波Δ,李文君Δ

(1.廈門(mén)大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102； 2.廈門(mén)市手性藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102；3.華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362021)

?

紅杜仲的美白活性及其途徑研究

林錦彬1,2，任桐3，連一江1,2，李偉杰1,2，金鑫1,2，夏智波1,2Δ,李文君1,2Δ

(1.廈門(mén)大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102； 2.廈門(mén)市手性藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102；3.華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362021)

目的 研究紅杜仲的不同乙醇濃度醇提物對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞系酪氨酸酶活性、黑素合成的影響，初步探討紅杜仲作為皮膚美白劑或色素沉積藥物的可行性。方法 以不同濃度乙醇進(jìn)行回流分別獲得30%、50%、70%、95%乙醇提取的得到4種紅杜仲醇提物(PEE30、PEE50、PEE70、PEE95)，選取對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制活性最強(qiáng)的提取物；再以B16造模，采用MTS法、NaOH裂解法、L-DOPA氧化法分別測(cè)定其對(duì)B16細(xì)胞的影響；Western blot檢測(cè)PEE作用后Tyrosinase、TRP-1蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果 各紅杜仲醇提物在體外均具有抑制蘑菇酪氨酸酶的作用，效果最強(qiáng)的為PEE70。在不影響B(tài)16細(xì)胞的濃度內(nèi)，PEE70明顯降低B16細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素的合成量(P<0. 001)。Western blot結(jié)果表明，PEE70能夠顯著抑制黑素合成相關(guān)蛋白Tyrosinase、TRP-1的表達(dá)。結(jié)論 PEE能直接抑制B16細(xì)胞黑色素的合成，可用于美白產(chǎn)品或者色素沉積藥物的開(kāi)發(fā)，且上述變化通過(guò)抑制酪氨酸酶活性來(lái)完成。

紅杜仲；B16細(xì)胞；黑素合成；抑制作用

白皙和潔潤(rùn)的肌膚一直為絕大多數(shù)的婦女所推崇，而近年來(lái)隨著生活工作節(jié)奏的加快以及環(huán)境污染的加劇，由各種原因引起的色斑、色素沉著等已成為普遍問(wèn)題，因此，美白化妝品已成為護(hù)膚類(lèi)化妝品中的主流品種之一。目前，國(guó)際上比較認(rèn)可的黑素合成途徑為：酪氨酸-多巴-多巴醌-多巴色素-二羥基吲哚-酮式吲哚-黑素[1]。酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶和限速酶，其具有獨(dú)特的雙重催化功能，首先催化L-酪氨酸羥基化形成L-多巴，再氧化L-多巴形成多巴醌，之后多巴醌經(jīng)一系列的酶促和非酶促反應(yīng)后形成黑色素[2]。

紅杜仲藥材為夾竹桃科杜仲藤屬植物杜仲藤(Parabariummicranthum(A.DC.)Pierre)、紅杜仲藤(P.chunnianumTsiang)及毛杜仲藤(P.huaitingiiChunet Tsiang)的莖皮和根皮，或花皮膠藤屬花皮膠藤(EcdysantherautilisHay.et Kaw.)的干燥樹(shù)皮，主要含有生物堿、酚類(lèi)、有機(jī)酸、黃酮等化學(xué)成分，紅杜仲藥材可以治療風(fēng)濕骨痛、外傷出血等[3]。但是，目前尚未見(jiàn)紅杜仲提取物在美白化妝品方面的報(bào)道。本文主要研究紅杜仲醇提物的活性部位對(duì)酪氨酸酶活性與黑素合成的抑制，為開(kāi)發(fā)紅杜仲作為美白原料應(yīng)用于化妝品提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑：紅杜仲(廈門(mén)鷺燕醫(yī)藥有限公司)。雙抗(青霉素、鏈霉素)、EDTA、胰蛋白酶、PTU(苯硫脲)(美國(guó)Sigma公司)；MTS(Promega公司)，α-MSH(上海淘普生物科技公司)；Tyrosinase、TRP-1單抗(Boster公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；Ti-S型倒置熒光顯微鏡(日本Nicon)；多功能酶標(biāo)儀 SpectraMax M2(Molecular Devices)；冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅杜仲醇提物的制備：取紅杜仲30 g，加480 mL 30%乙醇浸泡40 min，85 ℃水浴回流提取2 h，過(guò)濾，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙醇后得到粗浸膏，將粗浸膏置于-80 ℃后用冷凍干燥機(jī)干燥即為PEE30，備用。同樣的方法制備PEE50、 PEE70 、PEE95。

1.2.2 蘑菇酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)： 根據(jù)Matsuda H[4]的方法并改良進(jìn)行蘑菇酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)。以 1.5 g/L的左旋多巴為底物，添加80 μL磷酸緩沖液及 40 μL不同濃度(4、8、16 μg/mL)提取物。然后加入30 μL的100 U/mL酪氨酸酶磷酸緩沖液，充分混勻，30 ℃恒溫在475 nm處測(cè)定吸光度，每5 s記1次數(shù)，連續(xù)測(cè)定30 s，以反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度作圖并進(jìn)行直線擬合，根據(jù)樣品孔與陽(yáng)性對(duì)照孔直線斜率的變化計(jì)算抑制率。陽(yáng)性對(duì)照為曲酸。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算公式如下(式中kT：樣品孔直線斜率；kC：陽(yáng)性對(duì)照孔直線斜率)：

蘑菇酪氨酸酶活性抑制率(%)=[1-kT/kC]×100%

IC50值定義為抑制率為50%時(shí)所需酪氨酸酶抑制劑的濃度，以樣品的濃度對(duì)酪氨酸酶的抑制率作圖并進(jìn)行擬合，讀取計(jì)算IC50值。

1.2.3 B16細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞增殖活性測(cè)定：實(shí)驗(yàn)中選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，每孔100 L，接種于96孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)觀察待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度紅杜仲醇提物的培養(yǎng)液200 μL，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔，培養(yǎng)72 h后，MTS法測(cè)定各孔吸光值(A)，并按照如下公式計(jì)算細(xì)胞的存活率，及細(xì)胞存活率≥90%作為標(biāo)準(zhǔn)確定紅杜仲對(duì)細(xì)胞的安全濃度。

細(xì)胞存活率(%)=A處理/A對(duì)照×100%。

1.2.4 細(xì)胞酪氨酸酶活性測(cè)定[5]：培養(yǎng)B16至對(duì)數(shù)期，按密度1×105/孔將B16接種于6孔板，每孔2 mL；于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液加入2 mL 100 nM的α-MSH(黑色素刺激劑)，24 h后每孔加入不同濃度的醇提物，每一濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔取平均值，孵育72 h。收集后的細(xì)胞每管加入1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)150 μL，4 ℃溶解半小時(shí)，13000 r/min，4 ℃離心20 min，收集上清液；在96孔板中每孔加入90 μL細(xì)胞裂解液和10 μL 0.25%的L-DOPA溶液，在 37 ℃ 反應(yīng)60 min。用酶標(biāo)儀在475 nm處測(cè)量各孔的吸光度，BCA法測(cè)定各孔蛋白含量并計(jì)算細(xì)胞酪氨酸酶相對(duì)活性。每一處理因素重復(fù)測(cè)定3次。

酪氨酸酶相對(duì)活性(%)= [(給藥組吸光度值/給藥組蛋白濃度吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值/對(duì)照組蛋白濃度的吸光度值)]*100%

1.2.5 細(xì)胞黑色素含量測(cè)定：細(xì)胞的接種密度、處理、培養(yǎng)條件及收獲方法同1.2.3。用1000 μL含10%DMSO(二甲基亞砜)的NaOH溶液(1M)溶解，于90 ℃下加熱2 h，細(xì)胞裂解液吸取100 μL加入到96孔中，405 nm處測(cè)定各孔的吸光值，BCA法測(cè)定各孔蛋白含量并計(jì)算細(xì)胞黑色素相對(duì)含量。每一處理因素重復(fù)測(cè)定3次。

黑素合成相對(duì)含量(%)= [(給藥組黑素含量的吸光度值/給藥組蛋白濃度的吸光度值)/(對(duì)照組黑素含量的吸光度值/對(duì)照組蛋白濃度的吸光度值)]×100%

1.2.6 Western blot法檢測(cè)Tyrosinase、TRP-1蛋白表達(dá)水平[6]：前處理同1.2.3，PIRA裂解取上清完后，BCA法測(cè)定蛋白含量，以30 μg蛋白樣品為各組上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜1 h；5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗為T(mén)yrosinase (1:200)或者TRP-1(1:200)，β-actin(1:10000)。4 ℃過(guò)夜；PBST洗5遍，每次10 min；二抗兔抗山羊或者兔抗搖床孵育1 h，PBST洗5遍，每次10 min；加入ECL底物顯色后普光，用ImageJ軟件讀取灰度值，取目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照組的百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 不同乙醇濃度紅杜仲提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的影響 實(shí)驗(yàn)證明，陽(yáng)性藥物曲酸的IC50值為(0.004±0.018)， PEE30、PEE50、PEE70、PEE95都能對(duì)蘑菇酪氨酸酶的活性產(chǎn)生抑制作用，其抑制蘑菇酪氨酸酶的IC50值分別為(0.246±0.128)、(0.131±0.067)、(0.057±0.044)、(0.069±0.032) mg/mL，效果最好的是PEE70，選取該部分提取物用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同濃度紅杜仲醇提物對(duì)B16細(xì)胞增殖活性的影響 紅杜仲70%醇提物作用于B16細(xì)胞72 h后，均會(huì)對(duì)B16細(xì)胞生長(zhǎng)活性產(chǎn)生不同程度的影響，見(jiàn)圖1。由圖1可知，在0～20 mg/L濃度范圍內(nèi)，PEE30、PEE50和PEE70作用于B16細(xì)胞72 h后的細(xì)胞存活率≥90%，定義在該濃度范圍為安全濃度；因此，PEE95的安全濃度范圍為0～15 mg/L。分別選取對(duì)B16細(xì)胞無(wú)明顯毒性(細(xì)胞存活率≥90%)的紅杜仲提取物用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度紅杜仲醇提物對(duì)B16細(xì)胞增殖活性的影響±s，n=3)Fig.1 Effect of different concentration PEE on B16 cell ±s，n=3)

2.3 不同濃度紅杜仲醇提物對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響 在5～20 mg/L范圍內(nèi)，PEE30效果最差，對(duì)酪氨酸酶活性影響差異均無(wú)顯著性；PEE95只有>10 mg/L才能對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活力起到明顯的抑制作用(P<0.01)。在安全濃度范圍內(nèi)，PEE50、PEE70對(duì)胞內(nèi)酪氨酸酶活力的抑制效果較好(P<0.05，P<0.01)，隨著給藥濃度的增加， B16 細(xì)胞酪氨酸酶活性逐漸降低，呈現(xiàn)較好的劑量依賴性，效果最好的是PEE70(P<0.001)，其對(duì)酪氨酸酶活性最高抑制率達(dá)到(38±1.072)%。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度紅杜仲醇提物對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響±s，n=3)*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，與對(duì)照組比較Fig.2 Effect of different concentration PEE on the Tyrosinase activity in*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

2.4 不同濃度乙醇紅杜仲提取物對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)黑素含量的影響 不同濃度乙醇紅杜仲提取物均能明顯降低B16細(xì)胞黑素含量(P<0.05，P<0.01)。與對(duì)照組相比，效果最佳的是PEE70，在5、10、20 mg/L時(shí)使B16細(xì)胞中的黑色素分別降低了(10±0.231)%、(27±0.523)%、(36±0.896)%，隨著濃度的增加呈現(xiàn)了較好的劑量依賴性，見(jiàn)圖3。由圖3可知，4種乙醇濃度提取的紅杜仲對(duì)黑素的合成具有抑制作用，其中，PEE70有最好的美白效果，而后對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖3 不同濃度乙醇紅杜仲提取物對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)黑素含量的影響±s，n=3)*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，與對(duì)照組比較Fig.3 Effect of different concentration PEE on the melanin*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

2.5 PEE70對(duì)Tyrosinase、TRP-1蛋白表達(dá)量的影響 黑色素研究表明[7]，酪氨酸酶是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，也是黑色素合成的限速酶，它通過(guò)將酪氨酸羥化，產(chǎn)生L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)，然后再將L-DOPA進(jìn)一步氧化成多巴醌，從而形成黑色素，它的過(guò)量表達(dá)是導(dǎo)致色素沉著過(guò)度的主要原因。

以PEE70為效應(yīng)物，研究不同濃度效應(yīng)物對(duì)小鼠B16細(xì)胞中與黑色素生成相關(guān)蛋白Tyrosinase、TRP-1的蛋白表達(dá)量的影響，見(jiàn)圖4。由圖4可知，與空白組相比，加模型組達(dá)到了極顯著水平(P<0.001)；與模型組相比，濃度為10、20 mg/L的PEE70可導(dǎo)致小鼠B16細(xì)胞中Tyrosinase、TRP-1蛋白表達(dá)量顯著的降低(P<0. 01)，而內(nèi)參β-actin蛋白的表達(dá)量并沒(méi)有顯著變化。說(shuō)明PEE70可導(dǎo)致黑素合成關(guān)鍵蛋白Tyrosinase及酪氨酸酶相關(guān)蛋白1TRP-1都有一定程度上的降解。

圖4 不同濃度的PEE70對(duì)Tyrosinase、TRP-1蛋白表達(dá)量的影響*P<0.05, **P<0.01, 和***P<0.001，與對(duì)照組比較Fig.4 Effect of different concentration of PEE70 on Tyrosinase and*P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001，compared with control group

3 討論

由于化妝品潛在的突變和對(duì)皮膚的刺激作用，尋找天然產(chǎn)物作為美白劑成為化妝品行業(yè)的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)，天然產(chǎn)物既具有較高的安全性，又有一定的生理活性，滿足了消費(fèi)者的需求。紅杜仲是我國(guó)名貴滋補(bǔ)藥材，各國(guó)學(xué)者相繼開(kāi)展了大量研究以確定紅杜仲的活性物質(zhì)，不同的化學(xué)成分并分別具有不同的化學(xué)活性。特別是作為壯瑤醫(yī)常用的藥物之一，紅杜仲值得進(jìn)一步深入研究和開(kāi)發(fā)，目前還未見(jiàn)其在美白方向的報(bào)道[3]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多種體外實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度乙醇回流的紅杜仲的美白活性，確定PEE70效果最佳，其對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸酶活性和黑素合成量的抑制作用都能達(dá)到極其顯著的抑制作用(與對(duì)照組比，P<0.001)，且呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PEE70能夠顯著降低B16細(xì)胞中Tyrosinase、TRP-1的表達(dá)(與對(duì)照組比，P<0.01)，結(jié)合PEE70能夠很好的降低蘑菇酪氨酸酶活力、抑制B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，本研究認(rèn)為PEE70具有抑制皮膚黑素合成的作用，其作用途徑與抑制酪氨酸酶的生成量和激活有關(guān)。

綜上所述，紅杜仲在美白化妝品方向上具有一定的開(kāi)發(fā)前景，值得進(jìn)一步進(jìn)行活性成分的研究。本實(shí)驗(yàn)為紅杜仲的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但是由于生物體內(nèi)黑色素形成與積累過(guò)程比較復(fù)雜，其抑制途徑也是多方面的，因此對(duì)于紅杜仲是否還可以通過(guò)其他途徑阻止黑色素的合成與積累有待進(jìn)一步的深入研究。

[1] Chao HC, Najjaa H, Villareal MO, et al. Arthrophytum scoparium inhibits melanogenesis through the down‐regulation of tyrosinase and melanogenic gene expressions in B16 melanoma cells[J]. Exp Dermatol, 2013, 22(2): 131-136.

[2] Huang HC,Chang SJ, Wu CY, et al. [6]-Shogaol Inhibits α-MSH-Induced Melanogenesis through the Acceleration of ERK and PI3K/Akt-Mediated MITF Degradation[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 842569.

[3] Wu FJ,Wei YY,Lu SH, et al. The Research Situation of Red Eucommia Herbs [J]. J Guangxi Acad Sci, 2010 (3): 377-379.

[4] Matsuda H, Nakashima S, Oda Y, et al. Melanogenesis inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum in B16 melanoma cells[J]. Bioorg Med Chem, 2009, 17(16): 6048-6053.

[5] Komori Y, Imai M, Yamauchi T, et al. Effect of p-aminophenols on tyrosinase activity[J]. Bioorg Med Chem, 2014, 22(15): 3994-4000.

[6] Huang YC, Liu KC, Chiou YL, et al. Fenofibrate suppresses melanogenesis in B16-F10 melanoma cells via activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Chemico Biol Interact, 2013, 205(3): 157-164.

[7] Lin JY, Fisher DE. Melanocyte biology and skin pigmentation[J]. Nature, 2007, 445(7130): 843-850.

(編校：王冬梅)

Study on the Whitening activity and pathway of red eucommia herbs

LIN Jin-bin1,2, REN Tong3, LIAN Yi-jiang1,2, LI Wei-jie1,2, JIN Xin1,2, XIA Zhi-bo1,2Δ, LI Wen-jun1,2Δ

(1.Medical College,Xiamen University,Xiamen 361102,China; 2.Xiamen Key Laboratory of Chiral Drugs, Xiamen 361102,China； 3.School of Biomedical Science, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China;)

ObjectiveTo determine the impact of PEE with different ethanol concentration extract on the activity of tyrosinase in B16 melanoma and to explore the feasibility of PEE used as skin whitening agent make use of a model organism.Methods30%, 50%, 70%, 95%,different concentration of ethanol reflux got four kinds of PEE alcohol extract, respectively. And selected the most active inhibition to mushroom tyrosinase(PEE30、PEE50、PEE70、PEE95). The effect of extracts from the selected on B16 cell model was determined by MTS, NaOH splitting decomposition, L-DOPA oxidation progress. The change in protein expression level after ethanol extract of PEE was determined by Western bolt.ResultsThe capacity of inhibition to mushroom tyrosinase in each concentration of PEE extraction, but PEE70 had the most active inhibition. When challenged with B16 cell model, PEE70 showed the capacity of decrease in tyrosinase activities and melanin synthesis (P<0.01) and had a does dependence ; it also decreased Tyrosinase and TRP-1 expression compared with control B16 cells.ConclusionThese data support the idea that PEE can restrain melanogenesis, through its inhibitory effect on the activity of tyrosinase.

red eucommia herbs; B16 cells; melanin synthesis; inhibition effect

林錦彬，男，碩士，實(shí)驗(yàn)員，研究方向：中藥活性成分研究，E-mail：704959837@qq.com；夏智波，通信作者，男，副教授，研究方向：中醫(yī)藥研究，E-mail:xiazhibo@xmu.cdu.cn;李文君，共同通信作者，女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：糖尿病、腦缺血等，E-mail:liwenjun@xmu.edu.cn。

R285

A

1005-1678(2015)12-0021-04