發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)

周永紅，張慧，成熙，柳國(guó)艷Δ，張黎明Δ

(1.第二軍醫(yī)大學(xué) 海洋生物醫(yī)藥研究中心，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué) 海醫(yī)系海洋生物技術(shù)教研室，上海 200433)

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發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)

周永紅1,2，張慧1,2，成熙1,2，柳國(guó)艷1,2Δ，張黎明1,2Δ

(1.第二軍醫(yī)大學(xué) 海洋生物醫(yī)藥研究中心，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué) 海醫(yī)系海洋生物技術(shù)教研室，上海 200433)

目的 獲得發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶，為深入研究發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的功能奠定基礎(chǔ)。方法 綜合運(yùn)用生物信息學(xué)分析發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶分子的序列特征和活性功能。通過(guò)設(shè)計(jì)帶有特異性酶切位點(diǎn)的引物，將編碼發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的核苷酸序列(CcSP1,CcSP2 和 CcSP3)從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出來(lái)，利用pET-24a(+)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(pET24a-CcSP1、pET24a-CcSP2和pET24a-CcSP3)，經(jīng)過(guò)篩選和鑒定正確后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌Rosetta(DE3).plysS。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)，利用SDS-PAGE電泳和Western-blot分析表達(dá)的重組蛋白。結(jié)果 SDS-PAGE電泳結(jié)果可見(jiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌分別在34、42和30kDa處有蛋白條帶，Western-blot檢測(cè)顯示，這些蛋白可特異性與抗His抗體反應(yīng)，分別與預(yù)測(cè)重組蛋白分子量一致，鑒定為正確表達(dá)的目的重組蛋白。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族原核表達(dá)載體，獲得了目標(biāo)蛋白，為進(jìn)一步研究水母絲氨酸蛋白酶的活性和功能奠定基礎(chǔ)。

發(fā)形霞水母；絲氨酸蛋白酶；原核表達(dá)；重組蛋白

水母屬刺胞動(dòng)物門(mén)，是一類(lèi)分布廣泛、生物總量龐大的海洋浮游動(dòng)物。近年來(lái)，全球許多海域多次出現(xiàn)了大規(guī)模水母暴發(fā)現(xiàn)象。水母的暴發(fā)對(duì)海洋漁業(yè)、海濱旅游、沿岸工業(yè)和涉海人員安全等造成很大威脅，是繼有害藻華之后最大的海洋生態(tài)災(zāi)害。事實(shí)上，水母也是對(duì)人類(lèi)傷害最大的海洋動(dòng)物，水母蜇傷是最常見(jiàn)的海洋生物傷[1-3]。水母觸手上密布刺絲囊，當(dāng)觸及人體或動(dòng)物體時(shí)，發(fā)射刺絲進(jìn)行襲擊，同時(shí)釋放出毒液，引起局部疼痛、瘙癢、紅疹等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致呼吸、循環(huán)衰竭甚至死亡[4-5]。研究表明[3,6-9]，水母毒素是一類(lèi)主要存在于觸手組織中，包含多種毒性組分的蛋白質(zhì)與多肽類(lèi)毒素。水母毒素毒性大、活性強(qiáng)，具有溶血性、心血管毒性、酶活性、神經(jīng)毒性、肌肉毒性以及肝臟毒性等多種生物活性。

為探究與水母毒素生理活性密切相關(guān)的功能基因的表達(dá)情況，深入研究水母毒素蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及生物學(xué)活性，本研究構(gòu)建了我國(guó)東南海域的主要致傷水母發(fā)形霞水母(Cyaneacapillata)觸手組織cDNA文庫(kù)，利用大規(guī)模測(cè)序及生物信息學(xué)分析等手段獲得了包括金屬蛋白酶、離子通道蛋白、凝集素、抗氧化酶類(lèi)等在內(nèi)的一系列活性因子的編碼序列。本研究發(fā)現(xiàn)其中3條序列的開(kāi)放閱讀框所編碼的氨基酸序列與絲氨酸蛋白酶家族(serine proteinases，SP)高度同源，均包含一個(gè)典型的絲氨酸蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域，表明這3條序列所編碼的蛋白同屬絲氨酸蛋白酶家族。絲氨酸蛋白酶是一類(lèi)以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶，通過(guò)對(duì)蛋白酶原的激活或抑制而發(fā)揮調(diào)節(jié)因子效應(yīng)，在生物有機(jī)體中具有重要而廣泛的生理作用[10-11]。本研究將構(gòu)建發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族的原核重組表達(dá)載體，獲得重組發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶，為進(jìn)一步研究其活性及其在水母蜇傷過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫(kù)(本課題組構(gòu)建)[12]。pET-24a(+)載體購(gòu)于美國(guó)Novagen公司。菌株E.coliDH5α和Rosetta(DE3).plysS購(gòu)于北京博邁德生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶 (EcoR I、Xho I，Nco I和Hind III)、T4DNA連接酶和2×Taq Master Mix購(gòu)自美國(guó)NEB公司。蛋白Marker(170kDa)，DNA分子量Marker(DL 1 000、2 000、15 000)購(gòu)自日本TaKaRa公司。His標(biāo)簽抗體、HRP-羊抗鼠IgG抗體、PCR產(chǎn)物回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京天根生化公司。辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)顯影液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

黨的十六大以科學(xué)發(fā)展觀為指導(dǎo)，形成了建設(shè)生態(tài)文明的戰(zhàn)略思想。黨的十七大把生態(tài)文明建設(shè)列入全面建設(shè)小康社會(huì)奮斗目標(biāo)的新要求并作出戰(zhàn)略部署。黨的十八大報(bào)告更是把生態(tài)文明建設(shè)放在事關(guān)全面建設(shè)小康社會(huì)非常突出的戰(zhàn)略地位，指出只有樹(shù)立尊重自然、順應(yīng)自然、保護(hù)自然的生態(tài)文明理念，才能實(shí)現(xiàn)人與自然和諧相處，實(shí)現(xiàn)人的全面發(fā)展。這種認(rèn)識(shí)已深入社會(huì)主義現(xiàn)代化建設(shè)的各項(xiàng)事業(yè)，高校也不例外。校園文化建設(shè)是高校教育的重要組成部分，對(duì)青年大學(xué)生的成長(zhǎng)成才，特別是實(shí)現(xiàn)自我教育與自我塑造，有著至關(guān)重要的作用。如何將生態(tài)文明建設(shè)充分融入高校校園文化建設(shè)，用生態(tài)理念指導(dǎo)校園文化建設(shè)，對(duì)高校全面、協(xié)調(diào)、可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

主要儀器：梯度PCR儀(EDC-810，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、核酸水平電泳槽(BG-subMIDI，美國(guó)Bio-Rad公司)、超聲波破碎儀(MISONIX，美國(guó)Misonix Sonicators公司)、電泳儀(PowerPacTM，美國(guó)Bio-Rad公司)、電泳槽(Mini-PROTEANR?Tetra System，美國(guó)Bio-Rad公司)、凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司的G：BOX系統(tǒng))。

2.3 重組發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組表達(dá)載體pET24a-CcSP1、pET24a-CcSP2和pET24a-CcSP3分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta(DE3).plysS中，IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)8、10、12 h。SDS-PAGE表明：在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌的超聲裂解液、裂解液上清和沉淀中均有目標(biāo)蛋白表達(dá)，分別在約34、42和30 kDa處，與各融合目標(biāo)蛋白預(yù)測(cè)的分子量一致。見(jiàn)圖5。

發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族與多個(gè)其他物種來(lái)源的絲氨酸蛋白酶具有非常高的同源性，與海月水母A.aurita來(lái)源的SP1最相似。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶中特異性的活性中心GDSGGP、三聯(lián)催化殘基His， Asp， Ser(即HDS)和酶原激活位點(diǎn)RIVGG(或RVIGG/RVIAG/RIIAG)、CGG、TAAHC(或TASHC)、LGC(或VGE)、GGR(或GGS/GGE/GRQ)、SFG(或SFV/SWG)、ARV(或TPV/)和SWI(或DWI)等序列均在各物種中高度保守[8-19]。見(jiàn)圖2。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶被歸入無(wú)脊椎動(dòng)物的分支，并與海月水母Aureliaaurita來(lái)源的SP1最為相似，進(jìn)一步印證了多重序列比對(duì)的分析結(jié)果。見(jiàn)圖3。

2.2 發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建 從發(fā)形霞水母觸手cDNA文庫(kù)中分別擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽、編碼成熟蛋白的CcSP1(867 bp)、CcSP2(1113 bp)和CcSP3(780 bp)序列片段，梯度PCR結(jié)果表明3條序列的最佳退火溫度分別為55.5 ℃、56 ℃和54 ℃(見(jiàn)圖4)。利用pET 24a(+)表達(dá)載體分別構(gòu)建以上3條序列的重組表達(dá)載體，經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示序列連接正確、無(wú)任何位點(diǎn)突變，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，將鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET24a-CcSP1、pET24a-CcSP2和pET24a-CcSP3。

1.4 重組發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliRosetta(DE3).plysS感受態(tài)細(xì)胞中，利用含卡那青霉素和氯霉素的LB平板分別挑取陽(yáng)性重組菌和含有空載體pET24a(+)的表達(dá)菌， 37 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液按5%轉(zhuǎn)種于同種培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600=0.6～0.8，再加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，16 ℃，150 r/min振蕩，分別誘導(dǎo)培養(yǎng)8、10、12 h。將菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管，10000×g離心4 min，收集菌體，每管加入10 mL含1%Triton X-100的PBS，冰浴下超聲(100 W，72×5 s，間隔30 s)破碎，裂解菌體，分別留取裂解液50 μL進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。10000×g離心15 min(4 ℃)分別收集上清和沉淀，沉淀分別依次加入2、4、8 M尿素進(jìn)行溶解，取50 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳(80V 30 min，120 V 1 h)。

2.1 發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶序列的生物信息學(xué)分析 本研究共發(fā)現(xiàn)3條發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為CcSP1(GenBank：KU140658)、CcSP2(GenBank：KU140659)和CcSP3(GenBank：KU140657)，3種蛋白均含有信號(hào)肽，定位于細(xì)胞外。CcSP1序列編碼含有309個(gè)氨基酸殘基的蛋白，含1個(gè)ShKT毒素結(jié)構(gòu)域和1個(gè)絲氨酸蛋白酶Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域，分子量33.95 kDa；CcSP2編碼含有394個(gè)氨基酸殘基的蛋白，含2個(gè)ShKT毒素結(jié)構(gòu)域和1個(gè)絲氨酸蛋白酶Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域，分子量42.3 kDa；CcSP3編碼含有278個(gè)氨基酸殘基的蛋白，含1個(gè)絲氨酸蛋白酶Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域，分子量30.22 kDa。見(jiàn)圖1。3種蛋白的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

2 結(jié)果

1.5 重組發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的Western-blot鑒定 將各樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后在300 mA 2 h條件下將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NV)膜；于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉3 h，TBST洗滌3次(10 min/次)；將洗好的NV膜浸入TBST稀釋的小鼠抗His抗體(1:2000)中，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌NV膜3次后，使用1:4000辣根過(guò)氧化物酶(HRP)羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育3 h，TBST洗滌3次；使用G：BOX系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司)進(jìn)行顯影。

圖1 發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族結(jié)構(gòu)域示意圖紅色：信號(hào)肽，藍(lán)色：shkT毒素結(jié)構(gòu)域，綠色：Try_SPc結(jié)構(gòu)域Fig.1 Schematic diagram of functional domains of CcSPs.Red:signal peptides,Blue:shkT toxin domains,Green:Try_SPc domains

序列名稱氨基酸殘基數(shù)Mr(kDa)等電點(diǎn)(PI)二硫鍵親水性CcSP130933.959.198-0.312CcSP239442.309.2411-0.256CcSP327830.229.185-0.222

表2 發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Tab.2 Analysis of the secondary structures of CcSPs

1.3 發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的原核重組表達(dá)載體構(gòu)建 選擇原核表達(dá)系統(tǒng)載體pET-24a(+)。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族序列擴(kuò)增引物。CcSP1基因：1A03-F：5′-CCGGAATTCATGTGCAAAGATG-3′(EcoR I)，1A03-R： 5′-CCGCTCGAGATTGTTGATGTAGC-3′(Xho I)；CcSP2基因：13F05-F：5′-CCCATGGATGTGTAAAGATGTC-3′(Nco I)，13F05-R：5′-CCGGAATTCTCCTCTAGCAA-3′(EcoR I)；CcSP3基因：13H02-F：5′-CCCAAGCTTATGTGTTCAGCT-3′(Hind III)，13H02-R：5′-CCGCTCGAGGTTTCTTTTC-3′(Xho I)。以上引物由上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：上下引物各0.4 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、模板DNA 1 μg，加ddH2O至總體積為20 μL。程序設(shè)定：利用梯度PCR確定最佳退火溫度。PCR反應(yīng)條件為：①95 ℃ 30 s；②95 ℃ 30 s；③50 ℃～60 ℃ 30 s；④68 ℃ 1 min；⑤68 ℃ 5 min。其中②、③、④ 3個(gè)步驟在每次反應(yīng)中循環(huán)30次。以含發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶全長(zhǎng)cDNA序列的pUC19克隆質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增得到編碼SM001-A03(867bp)、SM013-F05(1113bp)和SM013-H02(780bp)成熟蛋白的核苷酸序列，PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收、1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切后的DNA片段，用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coliDH5α中，取菌液均勻涂布于含卡那青霉素的LB平板，PCR和酶切檢測(cè)重組克隆，將檢測(cè)合格的菌液送至華大基因公司測(cè)序。

圖2 發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族的多重序列比對(duì) #：絲氨酸蛋白酶中特異性的活性中心GDSGGP；*：三聯(lián)催化殘基His、Asp、Ser；◆：酶原激活位點(diǎn)RIVGG(或RVIGG/RVIAG/RIIAG)；…：CGG標(biāo)記；____：TAAHC(或TASHC)；□：LGC(或VGE)；&：GGR(或GGS/GGE/GRQ)；○：SFG(或SFV/SWG)；◇：ARV(或TPV)；●：SWI(或DWI)Fig.2 Multiple alignment analysis of CcSPs#:The active site motifs (GDSGGP);*:Aspartic acid (Asp)-histidine (His)-serine (Ser) catalytic triad;◆:Zymogen activation site RIVGG (or RVIGG/RVIAG/RIIAG);…:CGG;____:TAAHC (or TASHC); □:LGC(or VGE);&:GGR (or GGS/GGE/GRQ);○:SFG(or SFV/SWG);◇:ARV(or TPV); ●:SWI(or DWI)

圖3 發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶家族的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CcSPsA.aurita SP1(Genbank：AAO12213.1)；Papilio xuthus SP7(Genbank：BAM17893.1；Anopheles gambiae SP14(Genbank：ACN38264.1)；Lonomia obliqua SP6 (Genbank：AAV91457.2)；Helicoverpa armigera SP3(Genbank：ABP96916.1)

(5) 由上述結(jié)論可知,在地震動(dòng)的作用下鋼管塔下橫擔(dān)以下的部位較安全,下橫擔(dān)以上,尤其是中橫擔(dān)以上的部位變形較明顯,在塔頭處和上中橫擔(dān)之間的部分構(gòu)件出現(xiàn)了最大應(yīng)力,在進(jìn)行抗震分析時(shí)需要注意,在必要時(shí)需對(duì)薄弱的構(gòu)件進(jìn)行加強(qiáng).

圖4 CcSP1、CcSP2和CcSP3的梯度PCR擴(kuò)增結(jié)果1-8泳道的溫度分別為：52.0 ℃、52.4 ℃、52.7 ℃、53.3 ℃、54.0 ℃、54.8 ℃、55.5 ℃和56.0 ℃Fig.4 Gradient PCR amplification results of CcSPs, CcSP2, CcSP3Lane 1-8: 52.0 ℃，52.4 ℃，52.7 ℃，53.3 ℃，54.0 ℃，54.8 ℃，55.5 ℃ and 56.0 ℃

1.2 發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶序列的生物信息學(xué)分析 利用Blast對(duì)發(fā)形霞水母觸手組織cDNA文庫(kù)全部序列進(jìn)行同源檢索，獲得編碼絲氨酸蛋白酶質(zhì)粒的克隆號(hào)(SM001-A03、SM013-F05和SM013-H02)。綜合運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件及在線分析工具，對(duì)篩選出的絲氨酸蛋白酶全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白序列的理化性質(zhì)、蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域、二硫鍵、等電點(diǎn)、親疏水性、亞細(xì)胞定位等特征進(jìn)行分析。通過(guò)與不同生物物種間的同類(lèi)蛋白序列比對(duì)，分析其保守結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分析其親緣性。

2.4 重組發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的鑒定 Western-blot結(jié)果顯示，rCcSP1、rCcSP2和rCcSP3可與抗His抗體特異性反應(yīng)，分子量分別為34 kDa、42 kDa和30 kDa，與預(yù)測(cè)重組蛋白分子量一致。表明發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶在大腸桿菌E.coliRosetta(DE3).plysS中成功表達(dá)。但3種目的蛋白表達(dá)量均較低，且大多以包涵體的形式存在于沉淀中，上清表達(dá)量較少。見(jiàn)圖6。

圖5 SDS-PAGE電泳分析重組表達(dá)蛋白A：pET24a-CcSP1轉(zhuǎn)化表達(dá)菌(8 h); B： pET24a-CcSP2轉(zhuǎn)化表達(dá)菌(10 h); C：pET24a-CcSP3轉(zhuǎn)化表達(dá)菌(12 h)M：Marker；1：未誘導(dǎo)菌的超聲裂解液；2：IPTG誘導(dǎo)菌的超聲裂解液; 3：IPTG誘導(dǎo)菌的超聲裂解液上清；4：IPTG誘導(dǎo)菌的超聲裂解液沉淀箭頭所示位置為融合目標(biāo)蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant CcSPs proteinsA： pET24a-CcSP1 E. coli Rosetta(DE3).plysS(8 h); B：pET24a-CcSP2 E. coli Rosetta(DE3).plysS(10 h);C：pET24a-CcSP3 E.coli Rosetta(DE3).plysS(12 h)lane M: Protein marker; Lane 1: Whole cell sonicated lysates before the IPTG induction; lane 2: Total protein of IPTG induced E. Coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment; lane 3: Supernatant of IPTG induced E. Coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment; lane 4: Precipitation of IPTG induced E. ColiRosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragmentArrows indicating the position of fusion target proteins

不錯(cuò)，《罕哈冉惠傳》中出現(xiàn)了不少反映佛教思想的內(nèi)容。如學(xué)者們指出的，當(dāng)哈冉惠和他的兩個(gè)兄弟遭蟒古斯暗害，誤食了蟒古斯投下的毒藥后，哈冉惠變成了長(zhǎng)有九十五顆頭的大黑蟒古斯，他的胞弟烏蘭岱·莫日根變成了一尊石人，烏蘭岱的坐騎變成了一尊石馬，他的義兄弟吉爾吉斯·賽因·貝托爾則變成了一頭黃色的野豬。是兩位公主派出了維蘭·索龍嘎的兒子去向菩薩求救，菩薩將三件寶物——萬(wàn)能的金套繩、能起死回生的仙丹、智慧的金盤(pán)賜給了小童，小童用此三寶使三位英雄得救，恢復(fù)了原貌。菩薩，為眾人所知，當(dāng)然屬于重要的佛的形象，然而當(dāng)菩薩向小童授予三件寶物之前，卻說(shuō)出下面一段頗令人費(fèi)解的話：

和他玩一些在黑暗中才能玩的游戲，例如做手影，或拿一把小手電，關(guān)上燈，引誘他去拍打一開(kāi)一關(guān)的手電筒的光。寶寶玩得興奮，就忘了黑夜，待到發(fā)現(xiàn)黑夜并不可怕，以后就不再不讓關(guān)燈了。

圖6 Western-blot分析重組表達(dá)蛋白1：未誘導(dǎo)菌超聲裂解液；2：IPTG誘導(dǎo)菌超聲裂解液；3：IPTG誘導(dǎo)菌超聲裂解液上清；4：IPTG誘導(dǎo)菌超生裂解液沉淀Fig.6 Western-blot analysis with an anti-His antibodyLane 1: Whole cell sonicated lysates before the IPTG induction; lane 2: Total protein of IPTG induced E.coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment; lane 3: Supernatant of IPTG induced E.coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment; lane 4: Precipitation of IPTG induced E.coli Rosetta (DE3) pLysS with pGEX-6P-1 target fragment

3 討論

2008年美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)報(bào)道，全球每年被水母蜇傷的總?cè)藬?shù)達(dá)1.5億[13]。在我國(guó)沿海地區(qū)，水母蜇傷造成的危害也比較嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，2013年暑期僅北戴河人民醫(yī)院就收治水母蜇傷者1053人(截至當(dāng)年8月7日)[14]。水母蜇傷已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。研究水母毒素發(fā)揮多種強(qiáng)效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為闡明水母毒素的組成、毒性作用方式及研發(fā)水母蜇傷的防治藥物提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為充分利用水母毒素，開(kāi)發(fā)新型的海洋生物藥物提供先導(dǎo)分子。

2.3.2 專屬性 取空白孵育樣品（即“2.2.3”項(xiàng)下不含ZG02的兩相孵育體系）、ZG02對(duì)照樣品（即“2.2.3”項(xiàng)下含ZG02的兩相孵育體系）、肝微粒體孵育樣品[即“2.2.3”項(xiàng)下含ZG02兩相孵育體系按“2.2.4”項(xiàng)下方法處理后（孵育30 min時(shí)）所得樣品]各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見(jiàn)圖3。結(jié)果，內(nèi)標(biāo)和ZG02的峰形均良好，保留時(shí)間分別為0.70、1.57 min，孵育體系中的內(nèi)源性物質(zhì)并未干擾待測(cè)物的測(cè)定，提示本方法的專屬性良好。

本研究從發(fā)形霞水母觸手cDNA文庫(kù)中篩選獲得了三條編碼絲氨酸蛋白酶的序列，對(duì)其結(jié)構(gòu)、序列相似性等進(jìn)行了分析，CcSP1、CcSP2和CcSP3分別編碼33.95、42.3和30.22 kDa的蛋白，均含有信號(hào)肽，為分泌蛋白。預(yù)測(cè)CcSP1、CcSP2和CcSP3的均含有絲氨酸蛋白酶Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域，其中CcSP1和CcSP2還具有ShKT毒素結(jié)構(gòu)域，提示CcSPs很可能是作為毒素組分參與發(fā)形霞水母的生命活動(dòng)。此外多重序列比對(duì)分析和進(jìn)化樹(shù)分析均顯示CcSPs與海月水母A.aurita來(lái)源的SP1最為相似，根據(jù)數(shù)據(jù)提供者Rojas,A等描述SP1屬于胰蛋白酶，提示CcSPs可能作為消化酶而起作用。

已知絲氨酸蛋白酶類(lèi)廣泛存在于蛇、蜘蛛等有毒動(dòng)物的毒液中，作為毒素因子發(fā)揮重要作用，可能參與其他毒素組分的翻譯后修飾和擴(kuò)散。如蛇的毒液中含量最豐富的酶之一——蛇毒絲氨酸蛋白酶(snake venome serine proteinases , SVSPs)，它在凝血或纖溶系統(tǒng)等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用，可以干擾凝血自穩(wěn)機(jī)制，并引起組織壞死[15]。本研究通過(guò)構(gòu)建原核重組表達(dá)系統(tǒng)獲得了表達(dá)發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的大腸桿菌菌株和重組發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶融合蛋白(rCcSP1,rCcSP2和rCcSP3)，分子量分別為34、42和30 kDa，與預(yù)測(cè)重組蛋白分子量一致，表明得到了正確表達(dá)的目的重組蛋白，這為進(jìn)一步明確發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶的活性、功能及其在水母蜇傷中的毒性作用奠定了基礎(chǔ)。

[1] Dong Z,Liu D, Keesing JK. Jellyfish blooms in China: Dominant species, causes and consequences[J].Mar Pollut Bull, 2010, 60(7):954-963.

[2] Fenner PJ, Williamson JA. Fast liquid chromatographic-mass spectrometric determination of pharmaceutical compounds[J].Med J Aust, 1996, 165(11-12):658-661.

[3] Tibballs J. Australian venomous jellyfish, envenomation syndromes, toxins and therapy [J].Toxicon, 2006, 48(7):830-859.

[4] Burnett JW. Medical aspects of jellyfish envenomation: pathogenesis, case reporting and therapy[J].Hydrobiologia, 2001, 155(1-3): 1-9.

[5] Tibballs J. Australian venomous jellyfish, envenomation syndromes, toxins and therapy[J].Toxicon, 2006, 48(7): 830-859.

[6] David AB, Joseph WB，Philip A, et al. Partial purification of box jellyfish (Chiroex fleckeri) nematocyst venom isolated at the beachside[J].Toxicon, 1998, 36(8): 1075-1085.

[7] John JC, Lal AR, Ian MC, et al. Partial purification and characterization of a hemolysin (CAHI) from Hawaiian box jellyfish (Carybdea alata) venom[J].Toxicon, 2001, 39(7): 981-990.

[8] Hiroshi N, Kyoko T, Masahiro N, et al. Isolation and characterization of a novel protein toxin from the Hawaiian box jellyfish (sea wasp) Carybdea alata[J].Biochem Biophys Res Co, 2000, 275(2): 589-594.

[9] Laura G, Massimo A, Bella G, et al. Biologically active polypeptides in the venom of the jellyfish Rhopilema nomadica[J].Toxicon, 1997, 35(5): 637-648.

[10] 張智明.凝血酶的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué), 2006, 6(6):1-3.

[11] 陳曉翔, 楊程德, 顧越英. 纖溶酶功能研究進(jìn)展[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐, 2005, 5(5):430-432.

[12] Ruan Z, Liu G, Wang B, et al. First Report of a Peroxiredoxin Homologue in Jellyfish: Molecular Cloning, Expression and Functional Characterization of CcPrx4 from Cyanea capillata[J].Mar Drugs, 2014, 12(1):214-231.

[13] The National Science Foundation, 4201 Wilson Boulevard, Arlington, Virginia 22230[EB].USA. Jellyfish Gone Wild. http://www.nsf.gov/news/special_reports/jellyfish/textonly/biology.jsp.

[14] 王敏. 北戴河今夏海蜇?cái)?shù)量激增 超千人被蜇傷[EB].新華網(wǎng). http://www.hbnews.net/xwsq/gn/szyw/2013/08/703916.shtml.

[15] Serrano SM, Maroun RC. Snake venom serine proteinases: sequence homology vs. substrate specificity, a paradox to be solved[J].Toxicon,2005,45(8):1115-1132.

(編校：譚玲)

Molecular cloning and expression of a serine protease family from JellyfishCyaneacapillata

ZHOU Yong-hong1,2, ZHANG Hui1,2, CHENG Xi1，2, LIU Guo-yan1,2Δ, ZHANG Li-ming1,2Δ

(1.Marine Bio-pharmaceutical Institute, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; 2 Department of Marine Biotechnology, Faculty of Naval Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

ObjectiveTo obtain a single toxin component from the jellyfishCyaneacapillataand provide a foundation for the further study on bioactivity and function of the serine proteases fromC.capillata.MethodsPrimers designed with restriction enzyme were used to amplify the coding region of cDNAs (CcSP1, CcSP2 and CcSP3). PCR fragments were ligated with the pET-24a(+) vector to construct the recombinant plasmids (pET24a-CcSP1, pET24a-CcSP2 and pET24a-CcSP3). After screening and identification，the recombinant plasmids were transformed into the Rosetta(DE3).plysS for protein expression. After induction with IPTG, SDS-PAGE and Western-blot were used to detect the expression of the recombinant proteins.ResultsSDS-PAGE showed that the proteins of rCcSP1, rCcSP2 and rCcSP3 were expressed in a single band at about 34 kDa, 42 kDa and 42kDa, respectively. Western-blot detection with anti-His antibody further confirmed that these recombinant proteins were His-tagged CcSP1, CcSP2 and CcSP3 fusion protein were obtained.ConclusionProkaryotic recombinant plasmids ofC.capillataserine proteases are contructed and recombinant proteins are obtained, which establishes the foundation for future study on the function of serine proteases from jellyfish.

Cyaneacapillata; serine protease; prokaryotic expression; recombinant protein

國(guó)家自然科學(xué)基金(41306136; 81370833; 81401578)

周永紅，女，碩士，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)研究，E-mail: 171006165@qq.com；張黎明，通信作者，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)以及海洋生物傷防治研究，E-mail:lmzhang@smmu.edu.cn；柳國(guó)艷，共同通信作者，女，博士，副教授，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)以及海洋生物傷防治研究，E-mail: lgy_laurie@aliyun.com。

R82

A

1005-1678(2015)12-0001-05