絲素蛋白基人工角膜多孔支架的細(xì)胞相容性研究

宋大偉 馬義賓 聶蓉暉

角膜病是一種發(fā)病率高、治療困難的致盲性眼病。據(jù)資料報(bào)道，我國(guó)因角膜病需要接受角膜移植手術(shù)患者約在500 萬(wàn)人以上，但由于角膜資源嚴(yán)重短缺，每年全國(guó)進(jìn)行的角膜移植手術(shù)僅為5 000 例左右，絕大部分角膜損傷或角膜病患者沒(méi)有條件醫(yī)治［1］。人工角膜的研究和發(fā)展有望解決角膜資源短缺的問(wèn)題，為角膜病患者帶來(lái)治愈的希望。但目前人工角膜的研究仍處于初級(jí)階段，普遍存在生物相容性低的問(wèn)題［2］。蠶絲是最具有中國(guó)特色的一種天然蛋白質(zhì)生物材料，由于其優(yōu)異的生物相容性、力學(xué)性能和降解性能，日益成為組織工程學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［3］。本研究以絲素蛋白基人工角膜為基礎(chǔ)材料，研究其細(xì)胞相容性，為人工角膜的生物學(xué)檢測(cè)和體內(nèi)應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 只健康新西蘭白兔(購(gòu)自南京金陵種兔場(chǎng))，2 ～3 月齡，體質(zhì)量2.0 ～2.5 kg，雌雄不限。眼部經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查顯示屈光間質(zhì)透明，無(wú)眼前節(jié)病變。

1.2 主要試劑和儀器

利用鹽析法制備絲蛋白多孔支架(蘇州大學(xué)現(xiàn)代絲綢實(shí)驗(yàn)室)。DMEM、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco 公司)，胎牛血清(中美合資蘭州民海生物)，EDTA(乙二胺四乙酸二鈉，美國(guó)AMRESCO 公司分裝)，MTT(美國(guó)Sigma 公司)。CO2培養(yǎng)箱(上海力新儀器公司，HF121UV)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯，OLYMPUS CKX41)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司，Model 860)，掃描電鏡(德國(guó)蔡司，Supra55VP)，激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)徠卡公司，DMIRE2)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 兔角膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

空氣栓塞法處死新西蘭白兔，在無(wú)菌條件下迅速摘取眼球，用含慶大霉素的生理鹽水(1 000 U/mL)沖洗眼球，在解剖鏡下撕去內(nèi)皮及后彈力層，刮除上皮層，PBS 漂洗2 次，用眼科剪將角膜基質(zhì)剪成約1 mm×1 mm 的組織小塊，平鋪于培養(yǎng)瓶壁后放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2 h。待組織塊稍干、附著瓶壁后，加DMEM 培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合成片后，用含0. 25% 胰蛋白酶和0. 02%EDTA (1 ∶1)的混合消化液消化后傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用為傳2 ～10 代細(xì)胞，取第2 代細(xì)胞進(jìn)行波形蛋白免疫組織化學(xué)鑒定，鑒定方法見參考文獻(xiàn)4。

1.3.2 絲蛋白溶液的制備

將生絲(購(gòu)自蘇州制絲廠)放置到濃度為0.02 M的碳酸鈉溶液中，100 ℃處理20 min，去除生絲表面的絲膠蛋白。脫膠后的絲蛋白纖維用去離子水充分洗滌后，放置于60 ℃烘箱中烘干，再將其加入濃度為9.3 M 的溴化鋰溶液中，60 ℃烘箱放置4 h，獲得絲蛋白的溴化鋰溶液。隨后將絲蛋白溶液裝入透析袋(截留分子量14 000)，在流動(dòng)自來(lái)水中透析48 h后改用去離子水透析，每4 小時(shí)換水1 次，持續(xù)24 h。透析得到的絲蛋白溶液經(jīng)過(guò)在9 000 rpm 條件下離心2 次，每次20 min，獲得澄清的絲蛋白溶液，濃度約為7%。

1.3.3 絲蛋白－明膠多孔支架的制備

將明膠加入去離子水中，加熱到60 ℃，獲得明膠水溶液，調(diào)整明膠含量，制備質(zhì)量濃度為2%的明膠溶液。將明膠溶液同絲蛋白溶液共混，通過(guò)改變兩種溶液的配比，獲得含有不同濃度明膠和絲蛋白的混合溶液?；旌先芤褐薪z蛋白溶液濃度保持在3%，而明膠濃度分別為0.75%和1.28%，多孔支架制備完成后，明膠含量為20%、30%。將上述混合溶液放置到－20 ℃冰箱內(nèi)12 h，然后使用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥48 h。獲得的樣品放置于底部加有去離子水的干燥器中，抽真空處理6 h，獲得不溶于水的多孔支架［6］。同時(shí)，利用鹽析法［6］制備絲蛋白多孔支架進(jìn)行對(duì)比研究。

1.3.4 兔角膜成纖維細(xì)胞在絲素蛋白基人工角膜上培養(yǎng)

將絲素蛋白－明膠多孔支架切成直徑5 mm、厚度2 mm 的圓柱形，并用70%乙醇浸泡消毒30 min，隨后以PBS 洗滌3 次后放入24 孔板。在種植細(xì)胞之前，將支架在1 mL 培養(yǎng)液中放置12 h，使其充分吸收培養(yǎng)液以提高細(xì)胞黏附。細(xì)胞的種植密度為2 ×104/cm2。培養(yǎng)液每2 天更換1 次，培養(yǎng)時(shí)間為14 d［7］。作為對(duì)照，采用相同方法在鹽析法制備的絲素蛋白支架上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3.5 細(xì)胞活性和形貌

兔角膜成纖維細(xì)胞的活性通過(guò)DNA 含量測(cè)定試劑盒測(cè)定(美國(guó)Molecular Probes 公司)［8］。將種植細(xì)胞的多孔支架經(jīng)PBS 清洗后，加入含有2 ×10－3M 鈣黃綠素-AM (用于活細(xì)胞染色)和4 ×10－3碘化丙啶(用于死細(xì)胞染色)的溶液，于37 ℃培育30 min。隨后使用PBS 清洗，并通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞活性［9］。將經(jīng)PBS 清洗后的多孔支架以10%中性福爾馬林溶液固定，隨后在室溫下使用四氧化鋨溶液進(jìn)一步固定2 h。將固定后的樣品利用梯度乙醇溶液脫水，并在通風(fēng)櫥內(nèi)干燥。噴金后使用掃描電鏡觀察細(xì)胞形貌。

2 結(jié) 果

多孔支架上體外培養(yǎng)1 d 后，細(xì)胞在所有支架上都表現(xiàn)出良好的黏附性，有大量偽足形成。明膠含量20%支架上的細(xì)胞數(shù)量多于單純絲素蛋白支架上的細(xì)胞數(shù)量，而明膠含量30%支架上的細(xì)胞數(shù)量多于明膠含量20%支架上的細(xì)胞數(shù)量(見圖1)。

圖1 多孔支架上體外培養(yǎng)1 d 后兔角膜成纖維細(xì)胞掃描電鏡圖(1 ∶1 000 和1 ∶5 000)

多孔支架上體外培養(yǎng)14 d 后，所有支架上的細(xì)胞均有顯著增殖，并有大量細(xì)胞外基質(zhì)形成。絲素蛋白支架上細(xì)胞數(shù)目在體外培養(yǎng)10 d 時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著時(shí)間推移，細(xì)胞數(shù)目開始降低。而在明膠含量為20%、30%絲素蛋白－明膠多孔支架上，細(xì)胞數(shù)目在14 d 的連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)增加;14 d時(shí)，不同明膠含量的絲素蛋白－明膠多孔支架上的細(xì)胞數(shù)目均顯著高于鹽析法制備的絲素蛋白多孔支架上的細(xì)胞數(shù)目，明膠含量為30%的絲素蛋白－明膠支架培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目及活細(xì)胞數(shù)目明顯多于20%者(見圖2)。

在激光共聚焦顯微鏡下觀察，所有支架上培養(yǎng)14 d 時(shí)細(xì)胞數(shù)目明顯多于培養(yǎng)1 d;而且培養(yǎng)14 d時(shí)30%絲素蛋白－明膠多孔支架上的細(xì)胞數(shù)量及活細(xì)胞數(shù)量高于20%者;20%絲素蛋白－明膠多孔支架上的細(xì)胞數(shù)量及活細(xì)胞數(shù)量明顯多于鹽析法制備的絲素蛋白多孔支架(見圖3)。

3 討 論

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，絲素蛋白最早被用于手術(shù)縫合線。最近20 年，越來(lái)越多的研究表明絲素蛋白能夠用于生物醫(yī)學(xué)和組織工程的多個(gè)領(lǐng)域［12］。隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)絲素蛋白是多種組織再生(如骨、軟骨、血管、神經(jīng)以及皮膚)的良好載體，并已經(jīng)有多種產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)，表明絲素蛋白的生物相容性完全能夠滿足人工角膜的要求，是一種潛在的人工角膜材料［13］。

圖3 多孔支架上培養(yǎng)的兔角膜成纖維成纖維細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡圖(1 ∶700)

理想的人工角膜需要具有良好的力學(xué)性能和生物相容性，有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，避免炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)還要具有良好的光學(xué)性能，實(shí)現(xiàn)角膜的功能。近年來(lái)，天然生物材料由于其優(yōu)異的生物相容性受到研究者的普遍重視［10］。

細(xì)胞相容性尤其是成纖維細(xì)胞的相容性是評(píng)價(jià)人工角膜周邊支架的重要指標(biāo)［7］。通過(guò)調(diào)控絲蛋白溶液的揮發(fā)速率，可直接從其水溶液中獲得不溶的、能夠用于人工角膜光學(xué)部件的絲蛋白薄膜，并提高其柔韌性［10］。明膠是具有優(yōu)異生物相容性的生物大分子，將二者性能完美結(jié)合，制備出絲素蛋白－明膠多孔支架，可進(jìn)一步提高絲素蛋白支架的細(xì)胞相容性，滿足人工角膜的要求［9］。

為了方便同鹽析法制備的絲素蛋白多孔支架做比較，本研究制備絲素蛋白－明膠多孔支架的絲素蛋白－ 明膠混合溶液中，明膠的濃度分別20% 和30%，從而使制備出的多孔支架同鹽析法制備的絲素蛋白支架具有相似的孔徑。將兔角膜成纖維細(xì)胞在3 種不同的絲素蛋白多孔支架上進(jìn)行培養(yǎng)，以評(píng)價(jià)絲素蛋白－明膠多孔支架的相容性。

通過(guò)掃描電鏡觀察成纖維細(xì)胞的形貌發(fā)現(xiàn)，兔角膜成纖維細(xì)胞在所有支架上都表現(xiàn)出良好的黏附性，有大量偽足形成。隨著時(shí)間推移，細(xì)胞數(shù)目顯著增加，并有大量細(xì)胞外基質(zhì)形成。表明鹽析法制備的單純絲素蛋白支架和絲素蛋白－明膠多孔支架都能很好地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

在單純絲素蛋白支架上，細(xì)胞數(shù)目在體外培養(yǎng)10 d 時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著時(shí)間推移增殖細(xì)胞數(shù)目開始降低，死亡細(xì)胞開始出現(xiàn)并增多;而在絲素蛋白－明膠多孔支架上，細(xì)胞數(shù)目在14 d 的培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)增加，并且活細(xì)胞一直保持較高的含量。明膠含量達(dá)30%的支架上，細(xì)胞表現(xiàn)出更高的活性，死亡細(xì)胞含量極低。這表明通過(guò)將明膠加入絲素蛋白溶液，不僅有利于形成更好的孔結(jié)構(gòu)，同時(shí)還進(jìn)一步提高了支架的細(xì)胞相容性，使其能更好地滿足角膜組織再生的要求。

本研究表明，絲素蛋白－明膠多孔支架與原代分離的兔角膜成纖維細(xì)胞具有較好的細(xì)胞相容性，能夠更好地促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖;明膠的加入使得絲素蛋白－明膠支架具有更好的細(xì)胞相容性，可滿足角膜組織再生的要求，為絲素蛋白基人工角膜的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 許鳳蘭. 納米羥基磷灰石/水凝膠人工角膜研究［D］. 四川:四川大學(xué)，2005.

2 楊朝忠，柳林. 現(xiàn)代角膜移植學(xué)［M］. 北京:人民軍醫(yī)出版社，1998:167-170.

3 Wei G，Ma PX. Partially nanofibrous architecture of 3D tissue engineering scaffolds［J］. Biomaterials，2009，30(32):6426-6434.

4 殷曉棠，孫旭光，金秀英，等. 羥基磷灰石人工角膜支架生物相容性的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 眼科研究，2001，19(3):193-194.

5 陳家祺，張勝，郭琳潔，等. 體外培養(yǎng)重建角膜組織的技術(shù)探討［J］. 中國(guó)實(shí)用眼科雜志，2001，19(11):815-817.

6 Lu Q，Zhu H，Zhang C，et al. Silk self-assembly mechanisms and control from thermodynamics to kinetics［J］. Biomacromolecules，2012，13(3):826-832.

7 Ma PX. Biomimetic materials for tissue engineering［J］. Adv Drug Deliv Rev，2008，60(2):184-198.

8 Woo KM，Jun JH，Chen VJ，et al. Nano-fibrous scaffolding promotes osteoblast differentiation and biomineralization ［J］.Biomaterials，2007，28(2):335-343.

9 Nova A，Keten S，Pugno NM，et al. Molecular and nanostructural mechanisms of deformation，strength and toughness of spider silk fibrils［J］. Nano Lett，2010，10(7):2626-2634.

10 Lu Q，Hu X，Wang X，et al. Water-insoluble silk films with silk Ⅰstructure［J］. Acta Biomater，2010，6(4):1380-1387.

11 Lu Q，Zhang X，Hu X，et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds［J］. Macromol Biosci，2010，10(3):289-298.

12 朱志忠，周道伐，黎勉勤. 角膜病［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1986:84-97.

13 Lu S，Wang X，Lu Q，et al. Stabilization of enzymes in silk films［J］. Biomacromolecules，2009，10(5):1032-1042.