轉(zhuǎn)酪氨酸激酶C 基因神經(jīng)干細胞移植對脊髓損傷后熱休克蛋白的影響

李嘉欣 朱小蘭 周正芳，3 黃煥雷 郭惠明 范瑞新 鄭少憶范小平 陳寄梅 莊建 朱平

心臟大血管手術(shù)并發(fā)的缺血再灌注損傷可引起脊髓損傷，嚴重時可導(dǎo)致患者術(shù)后輕癱或截癱，是影響手術(shù)預(yù)后的嚴重問題［1］。目前，脊髓損傷仍無有效的預(yù)防及治療方法，神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)移植有望恢復(fù)受損脊髓的神經(jīng)功能［2］。然而，一般的NSCs 移植后不僅生存率低，而且會分化成膠質(zhì)細胞參與膠質(zhì)瘢痕的形成［3］。因此，有必要改造或調(diào)節(jié)NSCs 在脊髓中的分化和遷移。酪氨酸激酶C(tyrosine kinase C，TrkC)是神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)的高親和力受體［2］，NT-3 與NSCs 的TrkC 受體結(jié)合可促進NSCs 分化和遷移［4］。在脊髓缺血再灌注損傷過程中，應(yīng)激反應(yīng)是主要的損傷機制［5］，應(yīng)激狀態(tài)刺激熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)快速大量合成與釋放［6］。研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激反應(yīng)中，HSP70 有抑制脂質(zhì)氧化、保護線粒體以及維持蛋白自穩(wěn)等作用，能發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用［7］。因此，我們通過將轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 移植至受損脊髓內(nèi)，觀察HSP70 的濃度改變以及脊髓的病理改變，初步探討轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs移植對脊髓損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 NSCs 的培養(yǎng)和鑒定

選擇孕14 d Wistar 大鼠(購自中山大學(xué)實驗動物中心)，所有實驗方案經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準通過。取出Wistar 大鼠胎腦海馬組織，機械消化成單細胞懸液。加入NSCs 全培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)、傳2 代后使用。為了對照和區(qū)別本研究真正需要的NSCs，首先在無血清培養(yǎng)基中觀察細胞開始分化的時間、數(shù)量及形態(tài);此后再使用含生長因子的無血清培養(yǎng)基，使NSCs 分裂而不分化。NSCs 鑒定:原代培養(yǎng)細胞均為圓形亮球狀，第3 天開始貼壁分化，細胞漸漸變?yōu)樗笮?，伸出突?第6 天出現(xiàn)大量神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，突起交織成網(wǎng)狀。細胞共有4 種不同形態(tài):懸浮圓形亮球狀NSCs 樣細胞;具有1 ～2 個突起的神經(jīng)元樣細胞;多個細突起且不斷分支的少突膠質(zhì)細胞樣細胞;多個粗長突起的星形膠質(zhì)細胞樣細胞。含生長因子培養(yǎng)基中的NSCs 大多為圓形亮球狀，于第3 天可見正在分裂細胞，并在第4 天可見神經(jīng)球;亦可見有貼壁分化伸出突起的細胞，但這些細胞活力漸漸減小，于第5 天完全凋亡。

1.2 轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 的制備

(1)TrkC 引物設(shè)計和合成:根據(jù)GenBank TrkC cDNA 全長序列設(shè)計合成引物(Invitrogen 公司)，片段長度249 bp;(2)提取鼠腦總RNA:取0.1 ～0.5 g Wistar 胎鼠腦組織，用Trizol 法(Life Technologies 公司)提取細胞總RNA，在紫外分光光度計上測定230 nm 處吸光度(A)值，并以瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整;(3)用逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒(Takara 公司)，將mRNA 逆轉(zhuǎn)率成cDNA，回收目的片段;(4)外源性TrkC cDNA 的連接:將pMD18-T 質(zhì)粒(Takara 公司)和回收目的cDNA 片段用Kpn Ⅰ+Hind Ⅲ(Invitrogen 公司)雙酶切，T4 DNA 連接酶(Invitrogen 公司)連接，獲得pMD18-T-TrkC 質(zhì)粒;(5)轉(zhuǎn)化、擴增與提取pMD18-T-Trkc 質(zhì)粒;(6)TrkC基因測序;(7)pECFP-C1-TrkC 質(zhì)粒的構(gòu)建:同步驟(3);(8)脂質(zhì)體2 000(Invitrogen 公司)/pMD18-TTrkC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCs;(9)免疫熒光檢測TrkC 的表達:一抗為兔抗TrkC，二抗為羊抗兔IgM-羅丹明(均購自伯信生物科技有限公司)。

1.3 脊髓缺血損傷大鼠模型的建立與分組

90 只清潔級Wistar 大鼠(購自中山大學(xué)實驗動物中心)，雌雄不拘，9 周齡，300 ～350 g。實驗在室溫25 ～28 ℃的環(huán)境中進行，大鼠以苯巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后安裝人工呼吸器，切開胸部，在左鎖骨下動脈末梢處給降主動脈纏膠帶。隨后經(jīng)皮將溫度探頭放置在腰椎椎管內(nèi)，監(jiān)測脊髓溫度。全身肝素化后，在體外循環(huán)下于左鎖骨下動脈末梢處阻斷降主動脈，50 min 后解除阻斷，閉合胸部切口，繼續(xù)飼養(yǎng)。整個實驗過程中，持續(xù)監(jiān)測脊髓溫度和誘發(fā)電位，脊髓溫度逐漸下降提示降主動脈阻斷處以下部位的循環(huán)已停滯，脊髓發(fā)生缺血;體感誘發(fā)電位P1 潛伏期和波幅出現(xiàn)明顯變化提示脊髓發(fā)生缺血再灌注損傷。90 只大鼠均建模成功，將大鼠模型隨機分為3 組(每組30 只):(1)單純阻斷組，只進行單純阻斷降主動脈;(2)NSCs 移植組，阻斷降主動脈術(shù)后1 d 進行單純NSCs 移植;(3)TrkC-NSCs 移植組，阻斷降主動脈術(shù)后1 d 進行轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 移植。

1.4 NSCs 移植

固定大鼠，自腰、骶椎處做約0.5 ～1.0 cm 皮膚切口，暴露皮下組織，于L5 ～L6 或L6 ～L7 間隙沿下一棘突上方用毛細穿刺針穿刺，針尖斜向頭端，針體與水平線約呈40°角進針約1.5 ～2.0 mm 到達蛛網(wǎng)膜下腔，仔細體會有落空感。用10 μL 的Hamilton 注射器經(jīng)微量注射泵以1.5 μL/min 的注射速度進行移植，注射1.5 μL 細胞懸液，細胞總數(shù)為2×105個。注射完畢后保持注射器于原位約1 min，再緩慢退出。單純阻斷組則注射等量等滲NaCl 溶液。

1.5 脊髓組織取材和染色

每組于移植術(shù)后24 h、48 h、72 h、1 周、2 周分別處死3 只大鼠，將其以俯臥位固定于實驗臺上，背部備皮，依次切開皮膚、皮下組織、肌肉，分離椎旁肌，充分暴露L2 ～L4 段脊椎棘突及椎板。以咬骨剪和咬骨鉗去除棘突及椎板，暴露脊髓組織，以鑷子迅速輕輕取出脊髓組織，分段送檢。采用HE 染色觀察大鼠脊髓組織病理學(xué)改變，采用TUNEL 染色觀察脊髓細胞凋亡情況，采用Nissl 染色觀察神經(jīng)元尼氏小體變化;染色方法均同參考文獻8。

1.6 ELISA 檢測HSP70 水平

每組于移植術(shù)后24 h、48 h、72 h、1 周、2 周分別取3 只大鼠割尾靜脈采血，室溫靜置2 h 后離心(3 000 rpm，10 min)分離出血清，置于室溫下充分混勻。根據(jù)大鼠HSP70 ELISA 試劑盒(Enzo Life Sciences公司)說明書準備試劑，按照要求將標(biāo)準品或待測樣本加入酶標(biāo)板，并做好標(biāo)記;溫育后加入底物，充分混勻;在室溫下避光反應(yīng)15 min 后，加入終止液，充分混勻;在30 min 內(nèi)使用酶標(biāo)儀(SpectraMax M5，美國Molecular Devices 公司)在450 nm 處讀取A 值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20. 0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(ˉx ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.01 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

術(shù)后5 個時間點中，3 組大鼠脊髓組織細胞形態(tài)在術(shù)后1 周時差異最為明顯。

2.1 HE 染色結(jié)果

術(shù)后1 周，單純阻斷組可見神經(jīng)細胞受損、變性、壞死，形態(tài)腫脹，出現(xiàn)空泡化，有核固縮、核溶解現(xiàn)象;NSCs 移植組部分神經(jīng)細胞腫脹，可見嗜酸性細胞核，部分細胞漿呈空泡狀，但不及單純阻斷組嚴重;TrkC-NSCs 移植組神經(jīng)細胞形態(tài)接近正常，染色均勻(見圖1)。

2.2 TUNEL 染色結(jié)果

術(shù)后1 周，單純阻斷組可見廣泛分布的呈棕色顆粒細胞核的凋亡細胞，其細胞質(zhì)減少;NSCs 移植組可見一定量的凋亡細胞，其細胞質(zhì)減少;TrkCNSCs 移植組只見散在的凋亡細胞(見圖2)。

2.3 Nissl 染色結(jié)果

術(shù)后1 周，單純阻斷組可見尼氏小體溶解成沙粒狀，核溶解及空泡現(xiàn)象比較嚴重;NSCs 移植組可見核溶解現(xiàn)象，但程度較單純阻斷組輕;TrkC-NSCs移植組可見尼氏小體呈塊狀，染色較正常，神經(jīng)細胞形態(tài)較完整(見圖3)。

2.4 ELISA 檢測結(jié)果

3 組大鼠移植術(shù)后HSP70 水平均升高，于術(shù)后72 h 達到峰值，TrkC-NSCs 移植組各時間點的HSP70 水平均高于另外兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)。詳見表1。

3 討 論

圖1 神經(jīng)干細胞移植術(shù)后1 周3 組大鼠脊髓組織標(biāo)本HE 染色結(jié)果(×400)

圖2 神經(jīng)干細胞移植術(shù)后1 周3 組大鼠脊髓組織標(biāo)本TUNEL 染色結(jié)果(×400)

圖3 神經(jīng)干細胞移植術(shù)后1 周3 組大鼠脊髓組織標(biāo)本Nissl 染色結(jié)果(×400)

表1 NSCs 移植術(shù)后不同時間點3 組大鼠HSP70 水平(，pg/mL)

表1 NSCs 移植術(shù)后不同時間點3 組大鼠HSP70 水平(，pg/mL)

注:NSCs. 神經(jīng)干細胞;TrkC. 酪氨酸激酶C;HSP70. 熱休克蛋白70

在心臟大血管手術(shù)中，阻斷主動脈血流導(dǎo)致的脊髓缺血再灌注損傷可引起術(shù)后輕度癱瘓，甚至截癱［9］。及時預(yù)防并治療脊髓損傷是提高患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前已知脊髓缺血再灌注損傷是一個多因素參與的過程，包括應(yīng)激反應(yīng)、氧自由基損傷、興奮性氨基酸毒性損傷以及炎癥等［9-11］。熱休克蛋白家族具有調(diào)控細胞周期、調(diào)節(jié)細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞存活與凋亡等多種功能［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓缺血再灌注損傷過程中，尤其是在應(yīng)激反應(yīng)中，HSP70 快速大量釋放，發(fā)揮對抗氧化應(yīng)激及保護細胞的作用［7］。而且，HSP70 在神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞中差異表達，因此可利用HSP70 作為心臟大血管手術(shù)引起的早期缺血及神經(jīng)細胞應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物［6，12］。

NSCs 移植可通過細胞替代等機制治療脊髓損傷［2］。然而，普通的NSCs 移植到受損脊髓內(nèi)不僅存活率低，而且易分化成膠質(zhì)細胞從而形成瘢痕，不能有效發(fā)揮神經(jīng)保護作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，只需改造NSCs 或調(diào)節(jié)其在脊髓中的分化和遷移，即找到合適的靶點并提供足夠的底物，就有可能恢復(fù)受損的神經(jīng)功能［13-14］。TrkC 受體是NT-3 的高親和力受體［2］。NT-3 通過與TrkC 受體的胞外區(qū)結(jié)合，將神經(jīng)細胞存活和分化的信號傳遞到細胞內(nèi)部，促進NSCs 分化為神經(jīng)細胞［15］。轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 能高表達TrkC 受體，可提高其與內(nèi)源性NT-3 的結(jié)合，從而提高NSCs 在大鼠受損脊髓中的存活率［14］。

本實驗脊髓缺血損傷大鼠術(shù)后1 周脊髓組織病理學(xué)結(jié)果顯示，單純阻斷組脊髓神經(jīng)細胞形態(tài)腫脹，大量凋亡，尼氏小體減少;TrkC-NSCs 移植組神經(jīng)細胞及其細胞器的形態(tài)最接近正常，凋亡細胞最少;NSCs 移植組神經(jīng)細胞及凋亡數(shù)量介于上述兩組之間;提示NSCs 移植有保護神經(jīng)細胞作用，轉(zhuǎn)TrkC基因NSCs 移植的神經(jīng)保護作用更明顯。ELISA 檢測結(jié)果顯示，術(shù)后各時間點單純阻斷組HSP70 濃度均為3 組中最低，NSCs 移植組HSP70 濃度高于單純阻斷組，TrkC-NSCs 移植組HSP70 水平最高;提示NSCs 移植能促進HSP70 釋放，轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs移植促進HSP70 釋放的效果更明顯。

綜上所述，NSCs 移植對脊髓缺血再灌注損傷有保護作用，轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 移植的治療效果更佳，可能是通過替代受損神經(jīng)細胞，促進HSP70 釋放從而減輕應(yīng)激反應(yīng)，繼而起到神經(jīng)保護的作用。但轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 移植對大鼠脊髓保護的具體機制仍不清楚，有待進一步的研究和探索。

1 Messé SR，Bavaria JE，Mullen M，et al. Neurologic outcomes from high risk descending thoracic and thoracoabdominal aortic operations in the era of endovascular repair［J］. Neurocrit Care，2008，9(3):344-351.

2 Park KI，Himes BT，Stieg PE，et al. Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement:evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury［J］. Exp Neurol，2006，199(1):179-190.

3 Liu Y，Himes BT，Solowska J，et al. Intraspinal delivery of neurotrophin-3 using neural stem cells genetically modified by recombinant retrovirus［J］. Exp Neurol，1999，158(1):9-26.

4 Wang JM，Zeng YS，Wu JL，et al. Cograft of neural stem cells and schwann cells overexpressing TrkC and neurotrophin-3 respectively after rat spinal cord transection［J］. Biomaterials，2011，32(30):7454-7468.

5 Zhu P，Li JX，Chen JM，et al. Mechanisms of spinal cord injury in aortic surgery［J］. South China Journal of Cardiology，2013，14(1):68-76.

6 Hecker JG，McGarvey M. Heat shock proteins as biomarkers for the rapid detection of brain and spinal cord ischemia:a review and comparison to other methods of detection in thoracic aneurysm repair［J］. Cell Stress Chaperones，2011，16(2):119-131.

7 Morano KA. New tricks for an old dog:the evolving world of Hsp70［J］. Ann N Y Acad Sci，2007，1113:1-14.

8 黃成鋒，周正芳，郭惠明，等. 轉(zhuǎn)酪氨酸激酶C 基因神經(jīng)干細胞移植對脊髓損傷后腫瘤壞死因子-α 的影響［J］. 廣東醫(yī)學(xué)，2014，35(11):1637-1641.

9 Papakostas JC，Matsagas MI，Toumpoulis IK，et al. Evolution of spinal cord injury in a porcine model of prolonged aortic occlusion［J］. J Surg Res，2006，133(2):159-166.

10 Kocaeli H，Korfali E， Ozturk H， et al. MK-801 improves neurological and histological outcomes after spinal cord ischemia induced by transient aortic cross-clipping in rats［J］. Surg Neurol，2005，64(Suppl 2):S22-S27.

11 Savas S，Delibas N， Savas C， et al. Pentoxifylline reduces biochemical markers of ischemia-reperfusion induced spinal cord injury in rabbits［J］. Spinal Cord，2002，40(5):224-229.

12 Richter-Landsberg C. Heat Shock Proteins in Neural Cells［M］. New York:Springer，2009:1-12.

13 Lu P，Jones LL，Snyder EY，et al. Neural stem cells constitutively secrete neurotrophic factors and promote extensive host axonal growth after spinal cord injury［J］. Exp Neurol，2003，181(2):115-129.

14 Castellanos DA，Tsoulfas P，F(xiàn)rydel BR，et al. TrkC overexpression enhances survival and migration of neural stem cell transplants in the rat spinal cord［J］. Cell Transplantat，2002，11(3):297-307.

15 Gong Y，Cao P，Yu HJ，et al. Crystal structure of the neurotrophin-3 and p75NTR symmetrical complex［J］. Nature，2008，454(7205):789-793.