浙江南部地區(qū)漢族人群腎移植術(shù)后糖尿病患者KIR 基因多態(tài)性分析

高小民 吳琦 張巖 梁勇 戚小剛 陳必成 蔡勇 楊亦榮 鄭少玲 夏鵬

移植術(shù)后糖尿病(post-transplantation diabetes mellitus，PTDM)是腎移植術(shù)后長(zhǎng)期并發(fā)癥之一，發(fā)病率為2.5% ～24.0%［1-2］，其發(fā)生發(fā)展將會(huì)引起移植腎排斥反應(yīng)及敗血癥的發(fā)生，嚴(yán)重影響移植腎存活，導(dǎo)致腎移植受者病死率及心血管事件發(fā)生率升高。因此，隨著腎移植受者生存期的不斷延長(zhǎng)，PTDM 作為影響受者預(yù)后的重要因素之一，日益受到關(guān)注［3］。PTDM 具有2 型糖尿病的高度遺傳異質(zhì)性特點(diǎn)［4］，因此推測(cè)2 型糖尿病的易感基因也有可能是PTDM 的易感基因。2 型糖尿病的易感性被認(rèn)為與復(fù)雜的遺傳因素相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制與炎癥和免疫反應(yīng)密不可分，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道在免疫應(yīng)答中起重要作用的自然殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)基因多態(tài)性與2 型糖尿病發(fā)病相關(guān)［5］。本研究采用病例對(duì)照研究的方法，探討浙江南部地區(qū)漢族人群腎移植受者KIR 基因多態(tài)性與PTDM 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植中心行腎移植，且2009 年12 月至2010 年12 月期間在本中心隨訪的170 例浙江南部地區(qū)漢族腎移植受者。排除標(biāo)準(zhǔn):少數(shù)民族，移植術(shù)前已確診糖尿病，多器官移植或再次腎移植，處于急性應(yīng)激期、感染狀態(tài)或極度衰弱狀態(tài)，移植術(shù)后1 年后確診糖尿病的受者。共有146 例受者入組本研究。研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

采用1999 年世界衛(wèi)生組織或美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［6-7］:腎移植術(shù)前無糖尿病，移植術(shù)后血糖持續(xù)升高，且達(dá)到一天中任意時(shí)刻血糖≥11.1 mmol/L，或空腹至少8 h 后血糖≥7.0 mmol/L，即診斷為PTDM。如受者無明顯糖尿病癥狀，可行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，服用后2 h 血糖≥11.1 mmol/L即診斷為PTDM。結(jié)果需在非同日重復(fù)測(cè)量核實(shí)。

146 例腎移植受者術(shù)后均使用甲潑尼龍沖擊治療3 d，劑量分別為500、300、200 mg。術(shù)后免疫抑制維持期，25 例受者采用環(huán)孢素+ 嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil，MMF)+甲潑尼龍三聯(lián)免疫抑制方案，121 例受者采用他克莫司+MMF +甲潑尼龍三聯(lián)免疫抑制方案。環(huán)孢素起始劑量為6 ～8 mg·kg－1·d－1，他 克 莫 司 起 始 劑 量 為0. 05 ～0.15 mg·kg－1·d－1，隨后根據(jù)血藥濃度谷值調(diào)整劑量。MMF 起始劑量為1.5 ～2.0 g/d，最后維持在0.5 ～1.0 g/d。甲潑尼龍起始劑量為64 mg，隨后每日遞減8 mg，最后維持在4 ～6 mg/d。

1.2 研究方法

1.2.1 腎移植受者血液標(biāo)本基因組DNA 抽提

抽取受者前臂靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，用DNAfast200 微量基因組DNA 極速抽提試劑盒(購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司)提取外周血總DNA，置于－20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 KIR 基因分型檢測(cè)和計(jì)算

采用聚合酶鏈反應(yīng)－序列特異性引物技術(shù)(PCRSSP)進(jìn)行KIR 基因分型檢測(cè)，共檢測(cè)16 個(gè)KIR 基因，包括KIR 2DL1 ～5、2DS1 ～5、3DL1 ～3、3DS1、2DP1 和3DP1。根據(jù)NCBI Gen Bank 2009 年公布的KIR 等位基因編碼序列設(shè)計(jì)，并經(jīng)過BLAST 驗(yàn)證;依據(jù)人類生長(zhǎng)激素基因保守片段設(shè)計(jì)內(nèi)參引物;引物均由上海捷瑞生物工程有限公司公司合成(見表1)。

表1 KIR 基因PCR-SSP 分型法引物

取KIR 基因分型檢測(cè)試劑盒(天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)配套的濃縮Buffer 70 μL，加90 μL 去離子水，6 U Taq DNA 酶和10 μL DNA，混勻離心后分別向16 個(gè)孔中(孔內(nèi)含引物)加入10 μL 上述混合液，封膜后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

PCR 循環(huán)參數(shù):96 ℃預(yù)變性2 min;96 ℃變性20 s，62 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到2%的瓊脂糖凝膠孔中電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP 公司)下觀察電泳結(jié)果并拍攝成像，保存結(jié)果。

KIR 基因型頻率(f)=觀察到的KIR 基因陽性個(gè)數(shù)/被研究人數(shù);KIR 基因頻率(gene frequency，GF)=1 －。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較;非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)表示。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

截至2010 年12 月，146 例腎移植受者共確診PTDM 45 例，余101 例受者未發(fā)現(xiàn)血糖異常，作為正常對(duì)照組。PTDM 組45 例患者男性30 例，女性15 例，平均年齡(51 ±9)歲，中位確診時(shí)間為腎移植術(shù)后3.8 個(gè)月(1 ～12 月);8 例患者采用環(huán)孢素+MMF+甲潑尼龍三聯(lián)免疫抑制方案，37 例采用他克莫司+MMF +甲潑尼龍三聯(lián)免疫抑制方案。正常對(duì)照組101 例受者男性71 例，女性30 例，平均年齡(49 ±9)歲;中位隨訪時(shí)間為4.5 年(1 ～10 年);17 例采用環(huán)孢素+MMF +甲潑尼龍三聯(lián)免疫抑制方案，84 例采用他克莫司+MMF+甲潑尼龍三聯(lián)免疫抑制方案。兩組患者性別、年齡、免疫抑制方案比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t =0.34、χ2=0.192、χ2=0.020，P 均＞0.05)。

兩組患者KIR 基因頻率及基因型頻率見表2。其中，KIR 2DL4、3DL2、3DL3 和3DP1 為框架基因，在兩組所有個(gè)體中均表達(dá)，基因頻率和基因型頻率均為100%。KIR 2DL1、2DL3、2DS4、3DL1 和2DP1在兩組受體中的基因型頻率均超過90%。KIR 2DS2、2DS3 和2DS5 在兩組受體中的基因型頻率均小于30%。與正常對(duì)照組相比，PTDM 組KIR 2DL2、2DS2、2DS4 基因型頻率增高，其中KIR 2DL2 基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.004，P ＜0.05)。與正常對(duì)照組比較，PTDM 組KIR 2DL1、2DL3、2DL5、2DS1、2DS3、2DS5、3DL1、3DS1 和2DP1 基因型頻率均降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＞0.05)。KIR基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果示例見圖1。

圖1 KIR 基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖示例

表2 PTDM 組患者與正常對(duì)照組患者KIR 基因頻率和基因型頻率分布(%)

3 討 論

PTDM 的發(fā)病機(jī)制主要與使用免疫抑制劑導(dǎo)致胰島B 細(xì)胞受損、胰島素分泌減少和胰島素抵抗等因素有關(guān)，涉及復(fù)雜的免疫和炎癥反應(yīng)過程，因其病理生理學(xué)特點(diǎn)與2 型糖尿病相似，且具有高度遺傳異質(zhì)性，可以將其視為2 型糖尿?。?-9］。研究認(rèn)為，2 型糖尿病實(shí)質(zhì)是一種全身性、慢性、低度炎癥狀態(tài)，炎性標(biāo)志物能預(yù)測(cè)2 型糖尿病及其相關(guān)代謝紊亂的發(fā)生［10-11］，提示2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展與免疫和炎癥反應(yīng)密不可分。同時(shí)，2 型糖尿病是一種具有明顯遺傳易感性的多基因復(fù)雜性疾病。既往研究表明，與其發(fā)病相關(guān)的易感基因主要包括鈣蛋白酶10基因、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白10 基因、胰島素受體基因、胰島素受體底物-1 基因、脂聯(lián)素基因及胰島素降解酶基因等［12-15］。近年來，天然免疫及NK 細(xì)胞在1 型糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用得到廣泛研究［16-18］，而在2 型糖尿病或PTDM 方面的研究甚少。NK 細(xì)胞是來源于骨髓的大顆粒淋巴細(xì)胞，是天然免疫系統(tǒng)的核心，同時(shí)也是獲得性免疫應(yīng)答重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，在炎癥和免疫反應(yīng)過程中起重要作用，故NK 細(xì)胞數(shù)量或功能異常可能參與2 型糖尿病或PTDM 的發(fā)生。

KIR 基因定位于人類染色體19q13.4 的白細(xì)胞受體復(fù)合物中［19］，有著高度多態(tài)性，KIR 基因數(shù)目在不同NK 細(xì)胞克隆和不同個(gè)體有差異，其編碼產(chǎn)物KIR 主要表達(dá)于NK 細(xì)胞及部分T 細(xì)胞表面，通過特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類分子(HLA-A/B/C，主要為HLA-C)［20］，傳遞活化或抑制信號(hào)，從而調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞和相應(yīng)T 細(xì)胞的活性，使機(jī)體處于不同的免疫應(yīng)答狀態(tài)。關(guān)于KIR 與疾病相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，1 型糖尿病、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、銀屑病等自身免疫性疾病和腎癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等腫瘤相關(guān)性疾病，以及病毒感染等疾病的發(fā)生發(fā)展均與KIR 基因多態(tài)性相關(guān)［21-23］。Zuniga 等［5］對(duì)95 例患有2 型糖尿病的波多黎各患者進(jìn)行KIR 基因分型，發(fā)現(xiàn)KIR 2DL3/2DL3 純合基因型頻率增加，提示KIR 2DL3 可能為2 型糖尿病的易感基因;此外，研究結(jié)果還提示在2 型糖尿病患者中抑制性KIR 受體增加。

本研究結(jié)果顯示，PTDM 組患者KIR 2DL2 基因型頻率顯著升高，提示KIR 2DL2 可能為浙江南部地區(qū)漢族人群患PTDM 的易感基因。結(jié)合Zuniga等的研究，推測(cè)NK 細(xì)胞及部分T 細(xì)胞表面的KIR受體可能是以抑制性受體為主導(dǎo)參與PTDM 的發(fā)生，并通過抑制NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞的活性，降低其抗感染和免疫應(yīng)答的能力，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)紊亂，從而促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。然而，鑒于佐證文獻(xiàn)過少及本研究樣本量較小，且缺少KIR 配體研究，使結(jié)果存在一定誤差，因此在下一步研究中我們需要擴(kuò)大研究人群的樣本例數(shù)并結(jié)合KIR 配體進(jìn)行多層次分析。

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