人工老化對春小麥種子萌發(fā)及根尖超微結(jié)構(gòu)的影響

劉旭歡，賈永紅，阿里別里根·哈孜太，卓方方，石書兵＊

（1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052；2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 奇臺麥類試驗(yàn)站，新疆奇臺831800）

種子活力是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo) ，通常在種子發(fā)育的生理成熟期達(dá)到高峰。種子的成熟同時(shí)也標(biāo)志著活力開始下降，這種下降是不可逆轉(zhuǎn)的劣變過程。國內(nèi)外學(xué)者通過種子老化及劣變機(jī)理的研究［3］發(fā)現(xiàn)，可用人工加速老化法模擬種子的自然老化和劣變過程［4－5］。目前，關(guān)于種子老化及其相關(guān)方面的研究是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，并在大豆［6］、小麥［7］、玉米［8－9］和蔬菜［10］種子老化研究中發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)等發(fā)芽指標(biāo)呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，在萌發(fā)過程中種子及幼苗對不良環(huán)境的適應(yīng)力減弱，對不良貯藏條件的忍受力下降，表現(xiàn)出對輻射處理高度敏感以及種苗生長緩慢等現(xiàn)象，與此同時(shí)伴隨著種子活力的下降，種子細(xì)胞膜透性發(fā)生改變，滲透增加；種子在老化時(shí)膜功能受損，通常反映在老化的整粒種子膜透性增加［11］。迄今關(guān)于小麥種子活力遺傳力等方面的研究較多［12－13］，而將掃描電鏡、透射電鏡技術(shù)與化學(xué)方法結(jié)合在一起進(jìn)行植物結(jié)構(gòu)觀察，揭示該種植物最基本的生命活動(dòng)規(guī)律的研究逐漸多起來［14－16］。種子具有的功能與其細(xì)胞的結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，致使種子活力下降的根本原因是種子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化［15］。當(dāng)前，有關(guān)高溫高濕老化脅迫對農(nóng)作物、蔬菜種子各項(xiàng)生化指標(biāo)研究的文獻(xiàn)較多［6－10］，但高溫高濕老化脅迫對其根系細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道甚少，在新疆春小麥根系上研究超微結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)則更加稀少。因此，本試驗(yàn)考察了不同老化處理的小麥種子活力及其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，探討其間的相關(guān)性，為小麥留種、貯藏、測定種子活力等工作提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1．1 材料培養(yǎng)及處理

選用新疆種植面積較大的‘新春6號’小麥品種為供試材料，供試樣品均為2014年7月收獲種子。選取含水量在12%～13%范圍內(nèi)的參試材料種子各5份，參照宋松泉等［17］的方法，將參試種子放到溫度41 ℃、相對濕度100%的密閉容器中進(jìn)行人工加速老化處理，處理時(shí)間分別為2、4、6、8d，并以未經(jīng)老化處理的材料作為對照（CK），待種子含水量降至原狀態(tài)后再進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1．2 測定項(xiàng)目及方法

1．2．1 種子萌發(fā)指標(biāo) 按照國際種子檢驗(yàn)規(guī)程［18］進(jìn)行種子室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn)，重復(fù)4次，第4天開始記錄正常發(fā)芽種子數(shù)，第7 天記錄正常發(fā)芽種子總數(shù)。然后根據(jù)以下公式計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。

發(fā)芽率（%）＝（第7天發(fā)芽種子數(shù)／檢測種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽勢（%）＝（第4天發(fā)芽種子數(shù)／檢測種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（t時(shí)間內(nèi)發(fā)芽數(shù)／相應(yīng)發(fā)芽日數(shù)）

活力指數(shù)＝發(fā)芽率×第7天幼苗長度

平均發(fā)芽時(shí)間（MGT）＝∑Ti×Ni／∑Ni

式中，Ni為在時(shí)間Ti 內(nèi)新發(fā)芽的種子數(shù)；MGT 為判斷種子發(fā)芽速度和整齊度的指標(biāo)，MGT 越小，發(fā)芽速度及整齊度越高。高發(fā)芽率及小的MGT 是種子活力高的重要指標(biāo)。

1．2．2 幼苗鮮重和干重 先把各重復(fù)組中生長滿7d長勢均勻一致的20株幼苗清洗干凈，用濾紙把水分吸干，用天平稱取每個(gè)重復(fù)幼苗鮮重（mg），算其單株平均值；再將幼苗放入烘箱殺青并烘干至恒重，稱量其干重（mg），計(jì)算單株平均值。

1．2．3 透射電鏡觀察 將萌發(fā)72h春小麥胚根尖分別用2．5%戊二醛、1%鋨酸做前、后固定，隨后用樹脂618包埋，再將包埋好的樣品用型號為LKB－V超薄切片機(jī)切成厚度為50nm 薄片，最后將薄片分別用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色，并用HitachiH－600A 型透射電鏡觀察。

1．2．4 掃描電鏡觀察 取萌發(fā)72h春小麥種胚的胚根尖部，用2．5%戊二醛溶液固定1h后，經(jīng)0．1 mol／L磷酸鹽緩沖溶液清洗3～5 次，用1%～2%鋨酸固定1～1．5h，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水后，再分別經(jīng)過1∶1和1∶4的無水乙醇：丙酮溶液及純丙酮置換后，將樣品放置于日立IB－5離子鍍膜儀中鍍膜，上鏡掃描電鏡（日立S570）觀察。

1．3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，采用DPS 6．5軟件進(jìn)行有關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 人工老化處理對春小麥種子萌發(fā)特性的影響

表1顯示，隨著人工老化處理時(shí)間的延長，春小麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢，而平均發(fā)芽時(shí)間（MGT）表現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢，且在各老化處理間均存在極顯著差異（P＜0．01）。其中，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在老化處理4d后開始大幅下降，MGT 開始大幅延長，如老化處理8d種子的發(fā)芽指數(shù)比對照組（CK）降低了94．37%，此時(shí)的MGT 則是CK 的3．92倍。同時(shí)，種子萌發(fā)后的幼苗根長、鮮重、干重也隨人工老化時(shí)間延長表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，且老化處理間及其與CK 間均存在極顯著差異，同樣在老化處理4d開始大幅下降，如老化處理8d種子幼苗的根長、鮮重、干重分別比CK 極顯著降低34．99%、36．31%、41．90%，可能與籽粒內(nèi)內(nèi)含物劣變程度深淺相關(guān)。另外，不同老化處理間種子活力降低幅度較明顯，對照組種子活力指數(shù)（17．19）分別比老化處理2d、4d、6d、8d的種子高出15．58%、35．98%、82．00%、94．03%?？梢?，本實(shí)驗(yàn)條件下人工老化處理嚴(yán)重抑制了春小麥種子的萌發(fā)和幼苗生長，而且老化處理4d是種子活力下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

表1 不同老化處理下春小麥種子萌發(fā)和幼苗農(nóng)藝性狀的表現(xiàn)Table 1 The influence of different aging treatments on seed germination and seedling agronomic traits

2．2 老化處理對春小麥種子胚根尖表皮形態(tài)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2．2．1 胚根表皮形態(tài) 由圖版Ⅰ，1～10 可以看出，萌發(fā)72h后春小麥胚根表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)在不同處理間各異。其中，未經(jīng)老化處理胚根表皮發(fā)生輕微皺縮，表皮較為光滑，凹陷處可以看到根毛覆蓋在表面上（圖版Ⅰ，1、2）；加速老化處理2d的幼根僅表現(xiàn)為胚根表皮緊密程度較未老化種子表皮緊致，表面凹凸起伏，幾乎看不到根毛覆蓋，而此時(shí)的萌發(fā)指標(biāo)下降幅度不大，說明短暫劣變處理對種子傷害較輕，種子活力可得到一定程度恢復(fù)（圖版Ⅰ，3、4）；老化4d種子的幼根表皮皺縮程度進(jìn)一步加深，且表皮逐漸開始突起，此時(shí)種子活力可恢復(fù)程度明顯低于老化2d處理，說明隨著劣變時(shí)間的延長，種子活力下降較明顯（圖版Ⅰ，5、6）；至老化6d時(shí)部分種子已經(jīng)開始喪失活力，幼根外部形態(tài)表現(xiàn)為胚根尖表皮逐漸開始破裂，內(nèi)部細(xì)胞逐漸開始裸露（圖版Ⅰ，7、8）；當(dāng)老化8d時(shí)絕大部分種子已完全喪失活力，此時(shí)的種子對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)已失去高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等生產(chǎn)意義，此時(shí)幼根外部形態(tài)表現(xiàn)為畸形，胚根短而粗，表皮發(fā)黑且破裂嚴(yán)重，電鏡下可以發(fā)現(xiàn)胚根皮層互相分離，內(nèi)部結(jié)構(gòu)大面積裸露（圖版Ⅰ，9、10）。

2．2．2 胚根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu) 圖版Ⅰ，11～16顯示，各老化處理種子根尖細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)從正常→膨脹→消融的變化現(xiàn)象最為突出，其次是細(xì)胞內(nèi)電子致密物由少至多，質(zhì)壁分離現(xiàn)象變化較為明顯。其中，未加速老化處理種子吸脹萌發(fā)后的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞核、線粒體、液泡等發(fā)育正常且分布均勻（圖版Ⅰ，11）；在老化處理2d后萌發(fā)的胚根細(xì)胞內(nèi)，除了線粒體略微腫脹，隱約可見線粒體處于分裂中期，而其余細(xì)胞器結(jié)構(gòu)均未出現(xiàn)顯著變化（圖版Ⅰ，12），再比對CK 組與老化2d的種子活力指數(shù)、發(fā)芽率等指標(biāo)也可以看出，此時(shí)發(fā)芽力下降可能是由于線粒體膨脹變化即酸性酯酶活性大量增加引起的，但降低幅度不大；對于老化4d的胚根細(xì)胞而言，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化較老化2d處理明顯，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜分離，細(xì)胞核質(zhì)分散，細(xì)胞內(nèi)殘存一定量的電子致密物質(zhì)，細(xì)胞器出現(xiàn)溶解跡象（圖版Ⅰ，13）；老化6d的胚根尖細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞器溶解現(xiàn)象大幅提升（圖版Ⅰ，14、15）；老化8d的種子胚根尖部分細(xì)胞已形成空腔（圖版Ⅰ，16）。

3 討 論

一般認(rèn)為，種子在老化過程中，其內(nèi)部發(fā)生了一系列生理生化變化，它的各功能、結(jié)構(gòu)受到損傷，且老化程度越高，受損程度也就越大，最終導(dǎo)致種子質(zhì)量下降，如活力、生活力、貯藏能力、田間健植率和植株生產(chǎn)性能等下降，甚至喪失活力［19］。本實(shí)驗(yàn)條件下人工老化處理嚴(yán)重抑制了春小麥種子的萌發(fā)和幼苗生長，其種子萌發(fā)指標(biāo)和幼苗生長性狀的變化規(guī)律與前人研究結(jié)果一致。

本研究的發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明，老化4d種子的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)開始加劇變化，成為種子萌發(fā)能力的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。根系是吸收養(yǎng)分和水分的器官，同時(shí)也是物質(zhì)同化、轉(zhuǎn)換的重要器官，其結(jié)構(gòu)和活力與植物的耐性息息相關(guān)。通過電鏡對根尖表皮形態(tài)、內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，老化4d的根尖表皮開始突起、破損，細(xì)胞質(zhì)壁分離，電子致密物增多，一系列的急劇變化反映出高溫高濕老化脅迫下，根系是最早、最直接的受害部位，也印證了發(fā)芽試驗(yàn)得出的老化4d是種子萌發(fā)能力轉(zhuǎn)折點(diǎn)的結(jié)論。細(xì)胞器結(jié)構(gòu)是否完整對種子活力高低具有很大的影響，在高溫高濕老化脅迫初期，細(xì)胞膜受損程度較低，能夠使得細(xì)胞功能得到大致恢復(fù)，但是隨著脅迫程度的加深，根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步遭到不可逆破壞，種子才表現(xiàn)出發(fā)芽力降低甚至最終失去發(fā)芽能力。

4 結(jié) 論

作為衡量種子發(fā)芽能力、整齊度的發(fā)芽率、活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間都會(huì)直觀地影響田間幼苗苗情。本試驗(yàn)結(jié)果表明，‘新春6號’春小麥種子隨著老化劣變時(shí)間的延長，其活力指數(shù)、發(fā)芽率、幼苗根長、幼苗干鮮重、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)均呈明顯降低趨勢，且短時(shí)間內(nèi)高溫高濕脅迫對種子造成的傷害可以得到部分恢復(fù)，但劣變程度越深，種子自我修復(fù)的能力越低，對種子造成的傷害越重。通過對萌發(fā)72h不同老化處理間胚根形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察比較發(fā)現(xiàn)，種子逐步喪失活力的過程就是胚根表皮形態(tài)、內(nèi)部細(xì)胞器逐漸發(fā)生形變、質(zhì)變的過程。在種子活力逐漸降低的過程中，活力指數(shù)的變化幅度明顯大于發(fā)芽率，與胚根形態(tài)、細(xì)胞器的變化趨勢一致，說明活力指數(shù)對種子老化反應(yīng)更加敏感，因此它可以作為反映種子活力的良好指標(biāo)。

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圖版Ⅰ 不同老化處理下春小麥種子胚根微形態(tài)和根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)1～10．春小麥種子胚根表面微形態(tài)觀察：1、2．未老化處理對照，顯示表皮細(xì)胞緊密整齊，×200，×2 500；3、4．人工老化2d，×200，×2 500；5、6：人工老化4d，×200，×2 500；7、8．人工老化6d，×200，×2 500；9、10．人工老化8d，顯示表皮細(xì)胞成層狀脫落，皮層裸露，×200，×2 500．11～16．春小麥根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：11．未老化，×10 000；12．人工老化2d，×8 000；13．人工老化4d，×8 000；14、15．人工老化6d，×6 000，×2 500；16．人工老化8d，×3 000．PlateⅠ Radicle microstructure and ultrastructure of root tip cells of spring wheat with different accelerated aging treatments Fig．1－10．Radicle microstructure of spring wheat seeds：Fig．1，2．No－aging，showing epidermal cell of compact and in order，×200，×2 500；Fig．3，4．Accelerated aging 2days，×200，×2 500；Fig．5，6．Accelerated aging 4days，×200，×2 500；Fig．7，8．Accelerated aging 6days，×200，×2 500；Fig．9，10．Accelerated aging 8days，showing epidermis dropping piece by piece and cortical cells exposed，×200，×2 500．Fig．11－16．Ultrastructure of root tip cells of spring wheat：Fig．11．No aging，×10 000；Fig．12．Accelerated aging 2days，×8 000；Fig．13．Accelerated aging 4days，×8 000；Fig．14，15．Accelerated aging 6days，×6 000，×2 500；Fig．16．Accelerated aging 8days，×3 000．