甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒研究進(jìn)展

吳會杰　古勤生

摘 要： 甜瓜（Cucumis melo）是世界上熱帶和溫帶地區(qū)的一種重要葫蘆科作物，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，甜瓜感染甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）會造成重大經(jīng)濟(jì)損失。本文對甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒的分類地位、特性及發(fā)生分布、基因與致病性研究、病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動、影響傳播因素及抗性研究等進(jìn)展做一綜述。目前，關(guān)于該病毒的研究國內(nèi)外已有不少報(bào)道，但病毒致病機(jī)制的研究仍在探索，因此揭示其致病機(jī)制成為研究該病毒的首要任務(wù)，為該病毒的抗性研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 甜瓜； 甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒； 分類地位； 致病性

Abstract： Cucumis melo is one of the important Cucurbitaceae in the tropical and temperate regions and also a major economic crop in our country. Melon necrotic spot virus（MNSV） cause significant economic losses in melon. The taxonomic status，characteristics and distribution，analysis of genes and pathogenicity，virus cell-to-cell movement and influence factor of transmission and resistance of MNSV were reviewed. Although there were many researches on MNSV，but there are few reports on the virus pathogenic mechanism. Therefore，it is necessary to find the host factors related to the virus and reveal the pathogenicity mechanisms of MNSV.

Key Words： Cucumis melo； Melon necrotic spot virus； Taxonomic status； Pathogenicity

甜瓜（Cucumis melo）是世界上熱帶和溫帶地區(qū)的重要葫蘆科作物，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，感染甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）會造成重大經(jīng)濟(jì)損失。該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，我國主要在江蘇省海門市和山東省壽光市發(fā)生，國內(nèi)外對MNSV已有不少的研究，本文綜述了甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒的分類地位、特性及發(fā)生分布、基因與致病性研究、病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動、影響傳播因素及抗性研究等進(jìn)展，并展望了該領(lǐng)域未來的研究方向。

1 分類地位、特性與發(fā)生分布

MNSV屬于香石竹斑駁病毒屬（Carmovirus），粒體為球形，直徑約30 nm?；蚪M為正義單鏈RNA，約4.3 Kb，5端不含帽子結(jié)構(gòu)且3端不含poly（A）結(jié)構(gòu)，編碼5個開放閱讀框。主要通過種子、土壤中的真菌瓜油壺菌（Olpidium bornovanus）和黃瓜黑頭葉甲進(jìn)行自然傳播，另外還可以通過機(jī)械磨擦接種進(jìn)行傳播。其寄主范圍僅限于葫蘆科的一些植物，例如甜瓜[1]、黃瓜[2]、西瓜[3]、南瓜及葫蘆等。在甜瓜上引起的癥狀有：葉片、葉柄和莖上出現(xiàn)壞死斑或者褪綠斑（圖1），植株矮化，果實(shí)變小，嚴(yán)重影響作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，隨著種子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，該病害隨種子調(diào)運(yùn)遠(yuǎn)距離傳播將會嚴(yán)重影響我國甜瓜生產(chǎn)。日本最先報(bào)道MNSV侵染甜瓜[1]，其次為美國加利福尼亞[4]、希臘[5]、意大利[6]、突尼斯[7]及中國[8-9]等。

2 MNSV基因及侵染性克隆

已報(bào)道的MNSV分離物很多，其病毒基因序列有很高的一致性，如日本分離物-NH和-S的CP氨基酸序列一致性超過95%[10]，-NH和-NK核苷酸和氨基酸一致性是97.4%～99.5% 和 97.7%～100%。雖然序列一致性很高，但其致病力強(qiáng)弱卻有很大區(qū)別，-NK分離物不能系統(tǒng)侵染甜瓜，推測其運(yùn)動蛋白7A的絲氨酸與系統(tǒng)侵染有關(guān)[11]。-YS和-KS甜瓜分離物比-NH致病力強(qiáng)，易引起植株生長受阻[12]。-W西瓜分離物在甜瓜上不表現(xiàn)癥狀，可能與其缺乏細(xì)胞間的運(yùn)動有關(guān)[13]。國內(nèi)也研究了MNSV-HM分離物的全長基因序列，MNSV-HM分離物的氨基酸與MNSV-264的一致性達(dá)到98.1%[14-15]。

RNA病毒侵染性克隆的建立，使重組DNA技術(shù)及其他相關(guān)技術(shù)在研究中的應(yīng)用成為可能，從而克服了RNA病毒難以進(jìn)行遺傳操作的問題。MNSV在侵染性克隆方面的研究也有不少：成功構(gòu)建-Ma5和-A1等分離物的侵染性克隆[16-17]，并在侵染性克隆的基礎(chǔ)上進(jìn)行了-A1的突變及GFP重組[17]；Usami等[18]的研究表明p29的大片段同義突變導(dǎo)致了MNSV致病性的缺失，Mochizuki等[19]的研究表明p29與線粒體內(nèi)膜有關(guān)且是引起枯斑的致病因子，免疫雜交和免疫共定位試驗(yàn)表明細(xì)胞中正義鏈病毒RNA、cp蛋白和（ds）RNA的定位意味著病毒的復(fù)制與線粒體有關(guān)，而p29的瞬時(shí)表達(dá)揭示了它特有的靶標(biāo)是線粒體[20]。

3 病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動

植物病毒侵入寄主細(xì)胞后，病毒侵入植株并移動產(chǎn)生系統(tǒng)侵染需要2個基本的路徑：經(jīng)過葉肉細(xì)胞胞間連絲來實(shí)現(xiàn)的胞間轉(zhuǎn)運(yùn)和經(jīng)過維管系統(tǒng)的韌皮部篩管來實(shí)現(xiàn)的長距離轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞間的移動是從最初侵染的細(xì)胞移動到維管束鞘，然后通過維管束組織（通常為韌皮部篩管）進(jìn)行長距離運(yùn)輸，最后通過進(jìn)一步的細(xì)胞間移動而建立對幼嫩葉片的侵染[21]。植物病毒胞間轉(zhuǎn)運(yùn)過程大多受到病毒移動蛋白（movement protein，MP）調(diào)控，不同MP對病毒轉(zhuǎn)運(yùn)有不同的路徑和機(jī)制[22]。MNSV在寄主植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制也有不少相關(guān)研究。MNSV細(xì)胞間運(yùn)動是由7A和7B控制的[23]。7A突變體及融合熒光蛋白GFP定位揭示了7A RNA結(jié)合區(qū)域是MNSV進(jìn)行細(xì)胞間運(yùn)動所必須的[24]。7B包含一個疏水區(qū)域并結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及Nt/Ct結(jié)構(gòu)域，參與病毒細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間移動的分泌途徑，與熒光蛋白融合的7B通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位在積極跟蹤肌動蛋白微絲的高爾基體和胞間連絲上[25]。7B也是一個跨膜結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)模式為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜—高爾基體—胞間連絲（ER—GA—Pd）。7B突變體揭示了移動蛋白的結(jié)構(gòu)與MNSV在細(xì)胞間移動的關(guān)系，跨膜區(qū)附近的側(cè)翼區(qū)域能顯著地減少M(fèi)NSV在細(xì)胞間的移動；膜的插入對7B在細(xì)胞間移動起到很重要的作用。因此，MNSV細(xì)胞間的移動需要7B有秩序地轉(zhuǎn)運(yùn)，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，依賴COPII的高爾基途徑達(dá)到高爾基體，最后到達(dá)胞間連絲，完成病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動[26-27]。

4 影響傳播的因素

環(huán)境對植株生長的影響很大，其中溫度是關(guān)鍵因子之一，溫度改變對MNSV接種后植株的表現(xiàn)癥狀影響非常大。MNSV在日本的發(fā)生主要從冬季到第2年的初夏，夏季很少發(fā)生。在15、20、25 ℃ 3個溫度下，甜瓜接種MNSV 7 d后，15 ℃不產(chǎn)生系統(tǒng)癥狀，20 ℃出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀比例為20%，25 ℃有10%產(chǎn)生系統(tǒng)癥狀；接種14 d后，15 ℃出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀的達(dá)到30%，20 ℃達(dá)到50%，25 ℃則只有10%；接種21 d后，15 ℃產(chǎn)生系統(tǒng)癥狀的甜瓜苗達(dá)到90%，20 ℃出現(xiàn)80%，25 ℃表現(xiàn)低于20%，在25 ℃保持的許多甜瓜苗，雖然接種子葉的部位表現(xiàn)出典型的枯斑，但上部的真葉幾乎很少出現(xiàn)枯斑，表明MNSV的系統(tǒng)侵染與溫度有關(guān)。溫度變化試驗(yàn)表明，當(dāng)20 ℃培育14 d隨后轉(zhuǎn)移至25 ℃條件時(shí)，MNSV發(fā)生率降低了31.3%；而當(dāng)25 ℃培育14 d隨后轉(zhuǎn)移至20 ℃的條件時(shí)，MNSV發(fā)生率提高到68.8%，證實(shí)了MNSV的發(fā)生率與植株生長溫度有關(guān)[28]。當(dāng)甜瓜植株在15 ℃條件時(shí)，隱性抗性基因nsv的抗性能被MNSV-Chiba分離物打破。在15 ℃和20 ℃ 條件下，病毒RNA在抗性品種的原生質(zhì)里積累。摩擦接種子葉的甜瓜在15 ℃能在真葉上系統(tǒng)發(fā)生，但20 ℃條件下卻不能在真葉發(fā)生。因此，在低于20 ℃條件下，在甜瓜的抗病品種中的抗病基因nsv發(fā)生溫敏失活[29]。溫度變化對MNSV系統(tǒng)侵染的影響表明MNSV是溫度敏感型病毒，因此研究MNSV的致病機(jī)制時(shí)，溫度是必須要考慮的問題，MNSV的溫敏機(jī)制也是研究MNSV致病機(jī)制的核心問題。本課題下一步的計(jì)劃是在現(xiàn)有MNSV基因功能研究的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)手段，結(jié)合侵染性克隆和突變體的構(gòu)建，探尋不同溫度對病毒在植物體內(nèi)存在狀態(tài)及MNSV在植物體內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)運(yùn)及表達(dá)情況的影響，期望揭示溫度對甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒系統(tǒng)侵染的分子機(jī)制。

MNSV的傳播除了溫度之外，傳播介體的影響也不可忽視。研究表明所有的油壺菌在黃瓜、甜瓜和西葫蘆上都具有傳播MNSV的能力[30]，且油壺菌是MNSV種傳的輔助工具[31]，該病害的發(fā)生與油壺菌存在相關(guān)[32]。油壺菌不存在時(shí)，種子攜帶的病毒不能傳播到幼苗，在油壺菌的輔助下其病毒的種傳率在0.1%～5.3%[31]。研究表明，MNSV cp基因的氨基酸Ile 變?yōu)镻he導(dǎo)致在油壺菌表面不能檢測到MNSV，但病毒粒子在組裝和生物學(xué)方面未受影響。因此推測MNSV cp基因與油壺菌的傳播有關(guān)。-Chi和-W株系分別由油壺真菌Y1 和 NW1傳播，但-Chi不能由NW1傳播，反之Y1也不傳播-W株系。比較了2種不同分離物cp基因的差異及其三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同分離物病毒粒子表面許多氨基酸殘基存在差異，是油壺真菌不能有效傳播的原因[33]。此外，在水中也能檢測到MNSV[34]。目前，根據(jù)MNSV和傳播介體油壺真菌的地理分布，遺傳多樣性及親緣關(guān)系，MNSV被分為為歐美洲組，日本甜瓜組和日本西瓜組[35]。對MNSV帶毒種子的處理也有研究。用烘干處理和堆肥發(fā)酵處理2種方式處理MNSV侵染后的病殘?bào)w，烘干處理能減少M(fèi)NSV的侵染性；堆肥最高的溫度可以達(dá)到61.9～73.8 ℃，堆肥處理30 d極少能檢測到病毒的侵染[36]。MNSV苗期檢測其傳毒率至少為7%～8%，其種子的帶毒率為11.3%～14.8%。70 ℃處理144 h能有效減少M(fèi)NSV且不影響種子萌發(fā)[37]。這些研究成果都為健康種苗的獲得提供了理論指導(dǎo)，為甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

5 MNSV抗性基因標(biāo)記及抗性分析

基因是控制抗性的一個重要因素。MNSV抗性是單個隱性基因控制的，該隱性基因在甜瓜基因組11連鎖群上，并建立了17.7 cM的連鎖距離[38]。進(jìn)一步擴(kuò)大F2和BC1群體，建立3.2 cM的標(biāo)記，在BAC中找到了覆蓋遺傳距離0.73 cM的標(biāo)記，為nsv隱性基因的定位奠定了基礎(chǔ)[39]。目前，nsv隱性基因已經(jīng)引入商業(yè)品種中，表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗MNSV的性狀[40]?！瓺oublon接種MNSV不產(chǎn)生系統(tǒng)侵染癥狀，因此用抗病品種‘Doublon和感病品種‘ANC-42雜交系分析表明顯性基因Mnr1和Mnr2控制這種抗性，定位到19 cM上[41]。

3-UTR序列在打破寄主抗性方面有重要的作用。-264株系能打破寄主抗性和侵染非寄主植物千日紅，推測該抗性可能是3-UTR區(qū)的序列不同引起的[42]。隨后把-Ma5和-264的3-CITE序列互換，證實(shí)打破其寄主抗性主要是3-CITE區(qū)[43]。進(jìn)一步的研究表明-264能克服隱性基因和煙草的非寄主抗性，其主要是3-UTR區(qū)的一段49 bp的堿基，-Ma5的3-CITE與-264不同，在煙草中不能啟動有效地翻譯而阻止了病毒復(fù)制基因的表達(dá)；如果來源于感病寄主的eIF4E被表達(dá)，MNSV-Ma5就能在煙草中復(fù)制，表明煙草對-Ma5的抗性是由于3-CITE和eIF4E間的對立引起的[44]。-N能克服eIF4E介導(dǎo)的抗性，分析其序列發(fā)現(xiàn)在3-UTR存在一段55 bp的序列，該序列來自于南瓜蚜傳黃化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）的種間重組[45]。3-UTR序列在病毒研究中的作用越來越重要，因此在未來的工作中還會有其他的作用被挖掘。分析比較了被MNSV侵染的甜瓜和健康的甜瓜韌皮部蛋白質(zhì)之間的差異，共鑒定了19個差異蛋白[46]。病毒入侵與寄主防御是一個長期的進(jìn)化過程，尋找與病毒互作的寄主因子，揭示病毒的致病機(jī)理，分析其在寄主體內(nèi)如何生長繁殖，為控制該病害的發(fā)生發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

6 問題與展望

植物病毒學(xué)的研究目標(biāo)是搞清病毒的特性，鑒定侵染過程中寄主與植物如何互作，明確寄主抗病（或感病）及病毒致病的機(jī)制，最終控制病毒的危害。目前，關(guān)于該病毒的研究國內(nèi)外已有不少報(bào)道，但病毒致病機(jī)制和沉默抑制子的研究仍在探索階段，因此揭示其致病機(jī)制和沉默抑制子成為該病毒的未來的研究方向。

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