鹽脅迫對(duì)低溫預(yù)處理石榴種子萌發(fā)及幼苗生理生化的影響

武 沖，尹燕雷，陶吉寒，楊雪梅，馮立娟

（山東省果樹研究所，山東泰安271000）

鹽漬化地區(qū)林木稀少、土地荒蕪、生態(tài)條件惡化，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)剞r(nóng)林經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展［1］。如今人們?cè)絹?lái)越重視耐鹽植物的資源調(diào)查、耐鹽機(jī)制探索、耐鹽植物篩選利用以及耐鹽植物新品種培育的研究［2］。石榴（PunicagranatumL.）屬石榴科（Punicaceae）石榴屬（PunicaL.）植物，其果實(shí)具有抗細(xì)菌、抗寄生、抗病毒和抗癌等作用，花具有很高的觀賞價(jià)值，是集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益、觀賞價(jià)值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹。

石榴是海涂鹽浸土地果樹開發(fā)的先鋒樹種之一，可在含鹽量0.3%左右土壤上正常生長(zhǎng)［3］。目前有關(guān)石榴的研究重點(diǎn)集中在新品種選育、果實(shí)組分分析、果色形成機(jī)理等方面［4－7］，而在石榴抗逆性方面研究工作還很薄弱。低溫預(yù)處理可以提高種子抗鹽能力已在草本植物中得到多方面的證實(shí)［8－10］，而在木本植物種子方面的相關(guān)研究很少，目前還沒有關(guān)于低溫預(yù)處理石榴種子耐鹽萌發(fā)研究的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以山東棗莊主栽石榴品種‘嶧城大青皮甜’種子為材料，研究了低溫預(yù)處理石榴種子在鹽脅迫下的萌發(fā)能力、保護(hù)酶活性、可溶性蛋白含量、相對(duì)電導(dǎo)率等指標(biāo)響應(yīng)特征，初步探討石榴種子的抗鹽機(jī)理，以期為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2013年9月底在山東棗莊嶧城采集的‘嶧城大青皮甜’石榴。于2014年1月取出果實(shí)內(nèi)的種子，用紗布反復(fù)搓洗干凈備用。種子千粒重28.53g。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1 低溫預(yù)處理 2014年5月22日開始進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。將種子用3層濕紗布包裹，置于25℃培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行催芽。催芽時(shí)，每天用清水沖洗種子，保證種子萌發(fā)所需水分。2周后，選取籽粒飽滿的種子2 000 粒為一組，1800粒試驗(yàn)，200粒待用，共4組。用0.5% HgCl2對(duì)種子表面消毒10min，之后用清水反復(fù)沖洗5 次。將種子放入覆蓋濕紗布的15cm 培養(yǎng)皿中，置于2～4℃低溫下分別處理0（未低溫預(yù)處理，CK1）、5、10和15d后用于NaCl脅迫處理。

1.2.2 NaCl溶液處理 試驗(yàn)設(shè)置0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%等6種濃度NaCl溶液處理，以清水作為對(duì)照（CK2），3次重復(fù)，每重復(fù)100粒。在直徑15cm 培養(yǎng)皿中置2層濾紙，先用少量相應(yīng)濃度NaCl溶液浸潤(rùn)，將不同處理的石榴種子整齊擺放其中，培養(yǎng)溫度為25℃。在人工培養(yǎng)箱中萌發(fā)25d后取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 發(fā)芽能力指標(biāo) 參照《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》［11］公式計(jì)算發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)：

發(fā)芽率（%）＝種子發(fā)芽數(shù)／供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽勢(shì)（%）＝發(fā)芽進(jìn)程當(dāng)日發(fā)芽最多種子發(fā)芽數(shù)／供試種子數(shù)×100%

1.3.2 幼苗形態(tài)指標(biāo) 發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束后，在每個(gè)處理3次重復(fù)中分別隨機(jī)抽取10株幼苗，測(cè)其上胚軸和胚根長(zhǎng)。

1.3.3 幼苗抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量 取各處理已完全展開葉片，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，以及脯氨酸和可溶性蛋白含量的測(cè)定。SOD 活性的測(cè)定采用NBT 氧化還原法；POD 活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，以上指標(biāo)的測(cè)定方法均參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》［12］。CAT 活性測(cè)定采用紫外吸收法；脯氨酸含量的測(cè)定用茚三酮法；可溶性蛋白含量測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法，均參照《植物生理實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［13］。所有指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次，最終結(jié)果為試驗(yàn)平均值。

1.3.4 細(xì)胞膜透性 采用電解質(zhì)外滲電導(dǎo)法測(cè)定［14］。稱取0.3g發(fā)芽種子，沖洗干凈，加入10mL去離子水，充分振蕩后靜置24h，采用DDS211型電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率初值L1，沸水浴10 min冷卻至室溫，測(cè)其電導(dǎo)率終值L2，計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率，5次重復(fù)。

相對(duì)電導(dǎo)率（L）＝（L1－蒸餾水電導(dǎo)率）／（L2－蒸餾水電導(dǎo)率）×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007計(jì)算各指標(biāo)的平均值，并繪制圖表，采用SAS 統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA 方法對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較（LSD）［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下石榴種子萌發(fā)的影響

由表1可知，隨著鹽濃度升高，各低溫預(yù)處理石榴種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，并在0.1%鹽濃度下達(dá)到最高值。在0.1%鹽濃度下，石榴種子可以正常萌發(fā)，除低溫處理5d的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率與對(duì)照（CK2）相近外，其它處理均顯著高于CK2；在0.2%鹽濃度下，石榴種子發(fā)芽率除低溫處理5d外均顯著低于CK2，而發(fā)芽勢(shì)均與對(duì)照（CK2）差異不顯著；但當(dāng)鹽濃度高于0.3%時(shí)，各鹽脅迫處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)顯著低于CK2。在相同濃度鹽脅迫下，各低溫預(yù)處理石榴種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)也隨著處理間延長(zhǎng)先升后降，并均在處理5d時(shí)達(dá)到最大。低溫處理5d時(shí)，各鹽分梯度下種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢(shì)均高于相應(yīng)未低溫處理對(duì)照（CK1）；低溫預(yù)處理10d時(shí)，鹽濃度低于0.4%處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)也高于相應(yīng)CK1，其余均低于相應(yīng)對(duì)照，但未達(dá)到顯著水平；低溫預(yù)處理15d時(shí)，各處理種子的發(fā)芽率均低于相應(yīng)CK1，當(dāng)鹽濃度低于0.3%時(shí)種子發(fā)芽勢(shì)也低于CK1?？梢?，低溫處理5和10d能顯著提高石榴種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，并以低溫處理5d效果較好，長(zhǎng)時(shí)間低溫處理則抑制了種子萌發(fā)；石榴種子可以在鹽濃度低于0.2%條件下正常萌發(fā)，當(dāng)鹽濃度高于0.2%時(shí)萌發(fā)受到抑制，且隨著鹽濃度升高抑制作用越顯著；石榴種子在適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚恚?d）和低鹽脅迫（0.1%）條件下的萌發(fā)力比單一低溫或者低鹽處理更強(qiáng)。

2.2 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下石榴幼苗形態(tài)的影響

表2顯示，低溫預(yù)處理5d時(shí)，石榴幼苗胚根、胚軸長(zhǎng)度均顯著大于其它處理（P＜0.05）；低溫預(yù)處理10d石榴幼苗胚根、胚軸長(zhǎng)度稍小于CK1；低溫預(yù)處理15d 時(shí)，幼苗生長(zhǎng)受到抑制，顯著小于CK1。不同鹽濃度處理種子對(duì)幼苗胚根、胚軸生長(zhǎng)影響差異顯著（P＜0.05）。其中，幼苗胚根、胚軸長(zhǎng)度在鹽濃度為0.1%時(shí)顯著大于對(duì)照CK2，在濃度為0.2%時(shí)稍小于對(duì)照CK2，而當(dāng)高于0.3%時(shí)顯著小于對(duì)照CK2。另外，種子萌發(fā)最重要的是獲得壯苗，根冠比的大小是壯苗的重要標(biāo)志，根冠比越大，幼苗越壯，反之越弱。表2結(jié)果表明低溫處理5d、0.1%的低鹽濃度時(shí)石榴幼苗根冠比最大，幼苗健壯。可見，低溫處理和低鹽脅迫對(duì)石榴幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但長(zhǎng)時(shí)間的低溫和高濃度鹽處理對(duì)幼苗會(huì)造成傷害；幼苗在低溫處理5d和0.1%鹽濃度下的生長(zhǎng)比單獨(dú)低溫處理或低鹽脅迫條件下更快，即適當(dāng)?shù)蜏靥幚砜梢源龠M(jìn)石榴種子在低鹽條件下健壯生長(zhǎng)。

表1 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下石榴種子發(fā)芽影響Table1 Effect of pre－chilling treatment on germination of black Punica granatum seeds under salt stress

2.3 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下石榴幼苗保護(hù)酶活性的影響

2.3.1 SOD 活性 由表3可知，在鹽脅迫下，石榴幼苗SOD 活性隨著鹽濃度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，且各處理幼苗SOD 活性均在鹽濃度為0.3%時(shí)達(dá)到最大值，說明石榴幼苗在低于0.3%鹽濃度下可以通過提高SOD 活性來(lái)適應(yīng)外界鹽分變化，但當(dāng)鹽濃度高于0.3%時(shí)SOD 活性受到抑制，從而造成鹽害。同時(shí)，低溫處理5和10d不同程度地提高了幼苗SOD 活性，增強(qiáng)了石榴種子抗鹽萌發(fā)能力，且在低溫處理5d時(shí)與其它處理間差異顯著；低溫處理15d 時(shí)，幼苗SOD 活性顯著低于對(duì)照CK1，說明長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理對(duì)石榴幼苗生長(zhǎng)會(huì)造成傷害。

2.3.2 POD 活性 各低溫預(yù)處理石榴幼苗POD活性均隨鹽濃度的升高呈先升高后下降變化趨勢(shì)，并在鹽濃度0.3%時(shí)達(dá)到最大；在無(wú)鹽脅迫條件下（CK2），除低溫處理15d幼苗POD 活性顯著低于其它低溫處理外，而其它低溫處理間無(wú)顯著性差異；但在不同濃度鹽脅迫下，幼苗POD 活性在低溫處理5d均顯著大于其它處理，在低溫處理10d與對(duì)照CK1差異不顯著，而在低溫處理15d時(shí)顯著低于低溫對(duì)照。說明在鹽脅迫環(huán)境中，低溫處理5d能顯著增強(qiáng)幼苗POD 活性，但長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理對(duì)石榴幼苗生長(zhǎng)反而會(huì)造成傷害。

表2 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下幼苗生長(zhǎng)的影響Table2 Effect of pre－chilling treatment on seedling growth under salt stress

表3 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下幼苗保護(hù)酶活性的影響Table3 Effect of pre－chilling treatment on SOD，POD and CAT activities under salt stress

2.3.3 CAT活性 在相同低溫預(yù)處理時(shí)間內(nèi)，石榴幼苗CAT 活性變化趨勢(shì)與SOD、POD 相同，即隨著鹽濃度的升高而先升高后下降，當(dāng)鹽濃度0.3%時(shí)達(dá)到最大。低溫處理5d石榴幼苗CAT 活性在各鹽濃度處理下均顯著大于其它低溫處理；低溫處理10d幼苗CAT 活性除在0.3%鹽濃度下顯著高于CK1外，在其余鹽濃度下均與CK1無(wú)顯著差異；低溫處理15d幼苗CAT 活性在0.1%和0.3%鹽濃度下顯著低于對(duì)照CK1，在其它鹽濃度下均與CK1差異不顯著。

以上結(jié)果表明適當(dāng)時(shí)間的低溫處理（5d）可顯著提高石榴幼苗的保護(hù)酶活性，但長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理（15d）則降低了幼苗的保護(hù)酶活性；石榴幼苗在外界鹽濃度為低于0.3%時(shí)可以通過保護(hù)酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境，而當(dāng)鹽濃度高于0.3%時(shí)超出了其保護(hù)酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)范圍，從而發(fā)生鹽害。

2.4 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下石榴幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響

在鹽脅迫下，植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量增加，可能有助于提高植物對(duì)鹽脅迫適應(yīng)能力的逆境蛋白合成［16］。由表4知，隨著鹽濃度的升高，各低溫處理石榴幼苗可溶性蛋白含量逐漸增高，并在不同濃度鹽處理間差異顯著（P＜0.05），且大多顯著大于對(duì)照CK2。隨預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng)，各鹽濃度處理石榴幼苗的可溶性蛋白含量先降后升，其在低溫處理5d時(shí)比CK1不同程度降低，而在低溫處理10d和15d時(shí)卻不同程度地增加，但大多未達(dá)到顯著水平。即長(zhǎng)時(shí)間的低溫預(yù)處理可以提高石榴幼苗可溶性蛋白的合成。

同時(shí)，隨鹽濃度的升高，各低溫預(yù)處理石榴幼苗間脯氨酸含量逐漸升高，但鹽濃度低于0.2%的各處理間差異不顯著，而當(dāng)鹽濃度高于0.3%時(shí)顯著增加，尤其在0.4%和0.5%鹽濃度下劇增。隨著低溫預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各鹽濃度處理石榴幼苗表現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)，且鹽濃度越高這種趨勢(shì)越明顯；各低溫處理間脯氨酸含量在低鹽濃度脅迫下差異不顯著，當(dāng)鹽濃度高于0.3%時(shí)差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。說明鹽脅迫和低溫刺激促進(jìn)了石榴幼苗自身脯氨酸的合成，且鹽濃度越高、低溫處理時(shí)間越長(zhǎng)脯氨酸在石榴幼苗體內(nèi)積累越多。

2.5 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下石榴幼苗電導(dǎo)率的影響

植物膜系統(tǒng)會(huì)在鹽脅迫下受到影響，對(duì)鹽敏感的植物膜系統(tǒng)先遭到破壞［17］。由表5知，各低溫處理石榴幼苗電導(dǎo)率隨著鹽脅迫濃度的升高逐漸增加，其在0.1%和0.2%鹽濃度之間無(wú)顯著差異外，而在其它處理間差異顯著（P＜0.05），尤其當(dāng)鹽濃度為0.5%時(shí)，其相對(duì)電導(dǎo)率約為對(duì)照（CK2）的3倍，說明石榴幼苗膜系統(tǒng)在高鹽濃度下已受到嚴(yán)重破壞。同時(shí)，各鹽處理石榴幼苗電導(dǎo)率隨低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)先降低后升高，并在預(yù)處理5d時(shí)達(dá)到最低值。在無(wú)鹽脅迫下（CK2），低溫預(yù)處理5d幼苗相對(duì)電導(dǎo)率均顯著小于對(duì)照（CK1），而其余低溫處理與CK1均無(wú)顯著差異；在0.1%和0.2%鹽濃度時(shí)，不同低溫處理間相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著；當(dāng)鹽濃度高于0.3%時(shí)，僅低溫處理15d相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于其余處理，其它處理間差異不顯著。可見，適當(dāng)時(shí)間的低溫處理能增加石榴幼苗抗鹽力，但長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理抑制幼苗在鹽環(huán)境正常生長(zhǎng)。

表4 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下對(duì)幼苗可溶性蛋白和脯氨酸的影響Table4 Effect of pre－chilling treatment on soluble protein contents and proline under salt stress

表5 低溫預(yù)處理對(duì)鹽脅迫下對(duì)幼苗電導(dǎo)率的影響Table5 Effect of pre－chilling treatment on conductivity under salt stress

3 討 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)時(shí)間低溫預(yù)處理（5d）和低鹽脅迫（0.1%）可以提高石榴種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和幼苗根冠比，有利于壯苗形成；但長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理和高濃度鹽脅迫卻降低種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和根冠比，抑制幼苗生長(zhǎng)。另外，低溫處理5d石榴種子在0.2%鹽濃度下可以正常萌發(fā)，說明低溫預(yù)處理可以提高石榴種子抗鹽力，0.2%鹽濃度可以作為石榴種子抗鹽萌發(fā)的臨界點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，石榴樹對(duì)土壤鹽浸化有較好的適應(yīng)性，但含鹽量超過0.3%時(shí)會(huì)導(dǎo)致石榴樹勢(shì)減弱、黃化、早衰、發(fā)生凍害嚴(yán)重等現(xiàn)象，含鹽量超過0.4%時(shí)則會(huì)導(dǎo)致根系、枝條韌皮部和木質(zhì)部以及葉片發(fā)生鹽害死傷［18］?？梢姡狙芯拷Y(jié)果與之相似，其可能原因是石榴種子能在低鹽濃度中萌發(fā)，隨著幼樹生長(zhǎng)，其抗鹽能力也逐漸增強(qiáng)，但超過一定濃度時(shí)也會(huì)對(duì)樹體造成傷害。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下低溫預(yù)處理石榴幼苗保護(hù)酶（SOD、POD、CAT）活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)鹽濃度為0.3%時(shí)達(dá)到最大。即石榴幼苗在低鹽脅迫下可通過抗氧化酶系統(tǒng)SOD、POD和CAT 活性增強(qiáng)來(lái)清除過多自由基，而高鹽脅迫使體內(nèi)代謝趨于紊亂，體內(nèi)自由基急劇升高，這在李屬（Prunus）［19］、檉柳（TamarixchinensisLour.）［20］等植物中也得到驗(yàn)證。同時(shí)，石榴在鹽逆境萌發(fā)過程中，低溫處理5d幼苗的SOD、POD 和CAT 活性均比對(duì)照有不同程度提高，說明低溫處理石榴種子可以提高石榴幼苗在鹽環(huán)境的適生能力，這一結(jié)論與刺槐（RobiniapseudoacaciaL.）種子經(jīng)低溫處理能抗鹽萌發(fā)結(jié)論相同［21］。

另外，植物在失水時(shí)產(chǎn)生的一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)具有脫水保護(hù)功能［22－25］，本試驗(yàn)結(jié)果表明隨著鹽濃度的升高，石榴幼苗的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白和脯氨酸）含量也逐漸增加。據(jù)報(bào)道，大豆（Glycine max）品種Clark和Forrest的耐鹽性與葉片可溶性蛋白、脯氨酸的積累有關(guān)［26］；黑麥草在低溫和鹽漬脅迫之間存在“交叉適應(yīng)”現(xiàn)象，低溫處理3～5d顯著提高了種子萌發(fā)期的抗鹽能力［27］；低溫誘導(dǎo)小麥種子可以促進(jìn)種子內(nèi)源激素合成，從而提高種子抗鹽萌發(fā)性［28］。本試驗(yàn)表明長(zhǎng)時(shí)間的低溫處理可以提高石榴幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，而且隨著鹽濃度的升高它們?cè)隗w內(nèi)逐漸累積。未經(jīng)鹽脅迫石榴幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率在低溫處理間差異顯著，并在低溫預(yù)處理5d時(shí)顯著低于常溫對(duì)照，說明低溫預(yù)處理石榴種子可以提高幼苗抗鹽能力。

綜上所述，石榴種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及生理生化特性與低溫處理、鹽脅迫關(guān)系密切，適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚砑暗望}環(huán)境可促進(jìn)種子萌發(fā)。在低鹽環(huán)境下，低溫處理石榴種子幼苗能通過調(diào)整自身生長(zhǎng)增強(qiáng)幼苗植株的滲透調(diào)節(jié)能力，保證植株正常生長(zhǎng)所需水分，同時(shí)可溶性蛋白和脯氨酸含量的增加，保證幼苗自身保護(hù)酶的合成，維持正常的細(xì)胞代謝活性；另外，通過降低細(xì)胞膜脂過氧化程度，保證細(xì)胞膜的完整性等來(lái)提高其逆境適應(yīng)能力，從而有效降低膜脂過氧化對(duì)植株的傷害，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鹽性。本研究表明，石榴種子萌發(fā)前經(jīng)適度時(shí)間的低溫預(yù)處理，有利于石榴種子在鹽脅迫下的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，且低溫處理5d在0.1%鹽濃度環(huán)境中有利于石榴壯苗形成，是生產(chǎn)實(shí)踐中可以應(yīng)用的技術(shù)措施。

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