人骨關節(jié)炎軟骨細胞的體外培養(yǎng)及細胞形態(tài)學分析

唐新，鄭果，黃強，李棋，付維力，李箭，陳剛，周宗科，裴福興

(四川大學華西醫(yī)院骨科，四川 成都 610041)

實驗研究

人骨關節(jié)炎軟骨細胞的體外培養(yǎng)及細胞形態(tài)學分析

唐新，鄭果，黃強，李棋，付維力，李箭*，陳剛，周宗科，裴福興

(四川大學華西醫(yī)院骨科，四川 成都 610041)

目的 研究人骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨細胞的體外分離及培養(yǎng)方法，觀察各代人關節(jié)軟骨細胞的形態(tài)學特性，為臨床基礎研究提供參考依據(jù)。方法 取全膝置換術患者殘存的無菌膝關節(jié)軟骨，采用兩步酶消化法(胰蛋白酶+Ⅱ型膠原酶)分離培養(yǎng)人關節(jié)軟骨細胞，并進行傳代培養(yǎng)。通過倒置相差顯微鏡下觀察每代的細胞形態(tài)，甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色對細胞進行進一步鑒定后繪制生長曲線。結果 兩步酶消化法消化出的軟骨細胞呈接近圓形，培養(yǎng)2～3 d，細胞貼壁、變形，呈多角形或條狀，2周左右細胞融合成層，4代后出現(xiàn)明顯分化，軟骨細胞增殖和生長緩慢。形態(tài)學、免疫組織化學染色顯示細胞培養(yǎng)4代以內(nèi)可以保持表型的穩(wěn)定。結論 體外培養(yǎng)骨關節(jié)炎軟骨細胞4代以內(nèi)生長良好，生物學特性明顯，4代以后出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，提示我們2或3代骨關節(jié)炎軟骨細胞是用于實驗研究的最佳選擇。

骨關節(jié)炎；人軟骨細胞；細胞學

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種隨年齡增長而發(fā)生率明顯增加的退行性關節(jié)疾病，其發(fā)病是一個多因素參與的復雜過程[1]，至今其病因和發(fā)病機理仍不是十分清楚。大量研究表明，關節(jié)軟骨的退變被認為是引起OA和OA發(fā)展過程中最重要的病理環(huán)節(jié)[2-3]。軟骨細胞作為軟骨的唯一細胞成分，其細胞的生物學特性的變化和OA的發(fā)生發(fā)展密切相關[4-6]。

軟骨細胞體外培養(yǎng)是了解軟骨細胞生物學性狀和軟骨細胞分化、增殖及軟骨基質(zhì)合成過中影響因素的重要方法，同時也是尋找有效地防治療OA的重要基礎。由于OA本身存在的病理特征如軟骨的大量磨損和退變，導致體外分離培養(yǎng)骨關節(jié)炎患者軟骨細胞存在較大難度。因而目前針對骨關節(jié)炎的細胞水平的研究，大部分集中在動物關節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng)及相關研究領域[7-9]。

然而人骨關節(jié)炎是一個多因素的結果，單純依靠體外的模型獲得的OA軟骨細胞可能并不能真正意義上替代人的OA軟骨細胞，從而喪失其研究結果對臨床的指導意義。因此，從臨床上分離培養(yǎng)的人OA軟骨細胞可能是OA研究的最佳對象。我們對人OA軟骨細胞的分離、消化和培養(yǎng)進行了初步的研究，并對其細胞形態(tài)學特點進行了評價，為后期關于人OA軟骨細胞水平的相關研究提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象及樣本來源 所有標本均取自于四川大學華西醫(yī)院骨科10 例晚期骨關節(jié)炎行全膝關節(jié)置換患者，取材位置位于股骨內(nèi)、外髁負重過渡區(qū)的關節(jié)軟骨組織。其中男3 例，女7 例；年齡(61.7±6.69) 歲；體重指數(shù)(27.50±1.28)。骨關節(jié)炎的診斷標準參照美國風濕病學會膝骨關節(jié)炎診斷標準[10]，嚴格排除免疫性及其他可能影響膝關節(jié)病情的合并癥，所有患者術前經(jīng)全科討論意見一致。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者術前均經(jīng)其本人知情同意。

1.2 實驗試劑與儀器 主要實驗試劑：DMEM低糖培養(yǎng)基、0.01mol磷酸鹽緩沖液、0.25%胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、青-鏈霉素、Ⅱ型膠原酶、二型膠原抗體、胎牛血清、Cell Counting Kit-8、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、TRIzol、二甲基亞砜、四甲基偶氮唑鹽、DAB顯色試劑盒。

實驗設備：超凈工作臺(Heraeus公司，德國)、水浴搖床(memmert公司，德國)、倒置相差顯微鏡(olympus公司，日本)、37℃ 5%CO2孵育箱(sanyo公司，日本)、多功能酶標儀、離心機、電泳儀、微量天平等。

1.3 軟骨細胞獲取及培養(yǎng)方法

1.3.1 軟骨細胞的分離培養(yǎng) 膝關節(jié)置換術中在無菌條件下顯露膝關節(jié)軟骨組織，以銳利刀片取OA患者軟骨組織(股骨髁和脛骨平臺)，用生理鹽水沖洗3次，尖刀片刮除軟骨膜后生理鹽水再次沖洗2～3次，放入無菌的裝有適量DMEM低糖培養(yǎng)基(鏈霉素100 U/mL，青霉素100 U/mL)的50 mL無菌離心管中立即轉(zhuǎn)送至實驗室。采用兩步消化法分離關節(jié)軟骨細胞，將軟骨組織移入無菌培養(yǎng)皿中并用PBS液沖洗3次，仔細將附帶的軟組織或滑液去除，移入加有少量培養(yǎng)基的抗生素小瓶內(nèi)，干凈無菌眼科剪機械粉碎至1 mm3以下。之后再將組織塊轉(zhuǎn)入另一50 mL無菌離心管中，1 000 r/min低溫離心5 min，隨后加入5倍體積的0.25%胰蛋白酶消化20 min，棄去上清液，用低糖DMEM培養(yǎng)基洗滌2～3次。加入5倍體積的含0.2%Ⅱ型膠原酶低糖DMEM溶液，置37℃水浴箱中輕微振蕩消化，一般消化4～5次，每次25 min，每次消化后靜置5 min取上清液，移入事先盛有血清及低糖DMEM培養(yǎng)基的離心管中終止消化，然后1400 r/min離心5 min，棄去上清液，再用低糖DMEM培養(yǎng)基洗滌2次后待接種，每次如此分時段收集細胞，以免先消化下來的軟骨細胞因消化時間過長活性下降。匯合分時段收集的細胞懸液，200目金屬濾網(wǎng)過濾細胞懸液(用以除去雜質(zhì))，所得細胞沉淀經(jīng)吹打后移入含20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，恒溫，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔2 d換液。

1.3.2 傳代及鑒定前準備 原代培養(yǎng)細胞覆蓋瓶底80%以上時，吸盡培養(yǎng)基，PBS液清洗2～3次后加入0.25%胰蛋白酶，37℃，5%CO2孵育箱消化2～3 min，待鏡下觀察大部分細胞變圓漂浮時，加入20%含胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，并適度拍打培養(yǎng)瓶底以幫助貼壁細胞順利脫壁，1 000 r/min，離心3 min后加入適量20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸，血球計數(shù)板計數(shù)，104/mL傳代接種進入傳代培養(yǎng)。同時使用血蓋片準備進行細胞爬片，Ⅱ型膠原免疫組化及甲苯胺藍染色進行細胞形態(tài)學的進一步鑒定。

1.3.3 軟骨細胞爬片的制作和固定 每孔收集細胞8×104個，種植于6孔細胞培養(yǎng)板(底部放入血蓋片)，37℃，5%CO2條件下，培養(yǎng)至血蓋片上軟骨細胞融合率達到80%；移除培養(yǎng)基，以PBS液沖洗3次，每次1 min；4%多聚甲醛固定10 min；雙蒸水沖洗3次，將細胞爬片分開；-80℃長期保存，用時室溫自然解凍。

1.4 檢測指標

1.4.1 倒置相差顯微鏡觀察 在軟骨細胞分離培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)的各個時期通過倒置相差顯微鏡觀察OA軟骨細胞的形態(tài)、貼壁生長情況、生長特性及細胞密度，并拍照保存。

1.4.2 甲苯胺藍染色 對各代關節(jié)軟骨細胞用爬片技術，待細胞基本長滿后，取出細胞爬片，PBS液沖洗3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，自來水漂洗15 min，雙蒸水沖洗3次，放于染色架上，1%甲苯胺藍染色30 min，雙蒸水洗去多余的染液，100%無水乙醇脫水，中性樹膠封片倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.4.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學染色 對各代關節(jié)軟骨細胞用爬片技術，取出細胞爬片，放于染色架上，滴加正常非免疫動物血清室溫下孵育10 min。除去血清，滴加1︰1 000兔抗人Ⅱ型膠原一抗，4℃過夜。PBS液沖洗3次，每次5 min。滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育10 min，PBS液沖洗3次，每次5 min。DAB顯色，蘇木精復色，無水乙醇脫水，中性樹膠封片倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.4.4 細胞增殖檢測 取生長良好的第2，4，6代OA軟骨細胞采用CCK8法繪制軟骨細胞生長曲線。在96孔板中接種細胞懸液100μL，7 000個細胞；每孔加入10μLCCK-8；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；在460 nm測定吸光度。

共3塊96孔板，隔2 d換液。于第1、3、5、7、9、11天觀察，加入CCK-8后振蕩5 min后酶標儀上測吸光度值，波長為取細胞數(shù)的平均值作為結果，然后繪制折線圖來描繪細胞的生長情況。

2 結 果

2.1 細胞培養(yǎng)形態(tài)學變化 倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，軟骨原代細胞呈不均勻分布的多角形或條狀，形態(tài)欠規(guī)則，似短成纖維細胞樣，生長速度偏慢，約13 d左右可達80%，具有細胞密度依賴性。培養(yǎng)至第3代時即已出現(xiàn)長梭形細胞，且生長速度開始下降，4代后較為明顯，至第6代細胞形態(tài)幾乎全部變?yōu)殚L梭形，似成纖維細胞樣(見圖1)。

a 原代 b 2代 c 3代 d 4代 e 5代 f 6代

圖1 不同傳代的OA軟骨細胞形態(tài)學變化(×200)

2.2 細胞形態(tài)學染色鑒定 甲苯胺藍染色均可見細胞外基質(zhì)中染色呈陽性，原代軟骨細胞正染以藍色為主，經(jīng)多次傳代后，甲苯胺藍染色明顯減少，4代時排列仍密集，至6代以后甲苯胺藍染色藍色表現(xiàn)很少(見圖2)。

a 2代，甲苯胺藍染色 b 4代，甲苯胺藍染色 c 6代，甲苯胺藍染色 d 2代，二型膠原免疫組化 e 4代，二型膠原免疫組化 f 6代，二型膠原免疫組化

圖2 不同傳代的OA軟骨細胞形態(tài)學染色鑒定(×200)

Ⅱ型膠原免疫組化染色細胞核染色呈陽性，表現(xiàn)為棕黃色。隨著傳代次數(shù)的增加，棕黃色明顯減弱，陽性率降低，至第4代細胞僅有棕黃色著色顯著減少，至第6代時已基本呈陰性，無棕黃色。

2.3 生長曲線 利用CCK8法繪制軟骨細胞生長曲線，明確了該細胞的指數(shù)生長時間。第2代OA軟骨細胞經(jīng)培養(yǎng)后，1～5 d為潛伏期，增殖速率很慢，第5天細胞開始加速增殖，7 d左右增殖最明顯，呈指數(shù)增長。第9天后，細胞增長明顯放緩。第4、6代OA軟骨細胞的生長曲線與第2代細胞基本相同，但增殖峰值低，指數(shù)增長期時間短，且這一變化隨傳代次數(shù)的增多而愈發(fā)明顯(見圖3)。

圖3 第2、4、6代OA軟骨細胞生長曲線

3 討 論

由于種屬的差異，來源于動物的關節(jié)軟骨細胞其生物學特征與人關節(jié)軟骨細胞的生物學特征差異較明顯，且經(jīng)一些因素作用而來的骨關節(jié)炎模型并不能模擬出人骨關節(jié)炎的多因素影響，所以不能完全代替人類的軟骨細胞進行實驗研究。而從臨床上經(jīng)體外分離、培養(yǎng)所獲得的人骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨細胞，與人體的生理狀態(tài)相符合，其研究結果可信、可靠，對臨床進行骨關節(jié)炎的防治研究更具有指導意義。隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，已經(jīng)有眾多的學者開始由動物關節(jié)軟骨細胞的體外培養(yǎng)及誘導成模轉(zhuǎn)向從臨床獲得人關節(jié)炎軟骨細胞再進行實驗研究[11-13]。本實驗采用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法獲得了大量高純度、高活性的人關節(jié)軟骨細胞。研究結果發(fā)現(xiàn)4代以內(nèi)細胞生長良好，6代以后出現(xiàn)大量的去分化現(xiàn)象；形態(tài)學、免疫組織化學染色顯示細胞培養(yǎng)也證實4代以內(nèi)可以保持表型的穩(wěn)定。

軟骨細胞及周圍軟骨基質(zhì)共同構成了關節(jié)軟骨的主要成分。與其他結締組織不同，軟骨不包含血管，軟骨細胞是主要靠滑膜分泌的關節(jié)液所營養(yǎng)，且成熟的軟骨細胞被完全包裹在大量的細胞外基質(zhì)中而無法遷移或增生。因此，相對于其他結締組織軟骨生長和修復更加緩慢[14]。軟骨細胞無特異性標志物，但是軟骨細胞可以產(chǎn)生大量基質(zhì)成分氨基多糖和Ⅱ型膠原。Ⅱ型膠原為軟骨細胞的基因表達產(chǎn)物，可以通過其來確定軟骨細胞的表型。本實驗通過對軟骨細胞分泌的氨基多糖的甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原的免疫組織化學染色，再結合取材部位和培養(yǎng)過程中的觀察，證實所培養(yǎng)的細胞為人的軟骨細胞。

研究發(fā)現(xiàn)在人正常軟骨細胞體外培養(yǎng)過程中，由于細胞外環(huán)境與體內(nèi)內(nèi)環(huán)境差異的存在，軟骨細胞的表型難以保持長久的穩(wěn)定，進而細胞逐漸喪失其生物學特性，細胞形態(tài)、分化、增殖等都將發(fā)生一系列變化[15-17]。童迅等[18]研究顯示，正常人的軟骨細胞在培養(yǎng)5代以內(nèi)細胞生長良好，生物學特性明顯，5代以后出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖慢，生物學特征退變更早。胡炯等[19]研究顯示，骨性關節(jié)炎軟骨細胞形態(tài)似成纖維細胞，生長速度明顯較正常軟骨細胞慢，Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍染色均較弱，傳至第4代軟骨細胞生物學特性基本消失。我們的研究顯示，OA軟骨細胞在體外培養(yǎng)時隨傳代次數(shù)的增加，細胞會逐漸走向衰老和去分化；甲苯胺藍染色原代軟骨細胞正染陽性，傳代至4代后，甲苯胺藍染色顯著減少，至6代以后甲苯胺藍染色藍色陽性率很低；Ⅱ型膠原免疫組化染色細胞核染色呈陽性，隨著傳代次數(shù)的增加，至第4代細胞顯著減少，至第6代時已基本無棕黃色。這與童訊和胡炯等人的研究一致，表明骨關節(jié)炎軟骨細胞分泌的氨基多糖和Ⅱ型膠原隨傳代次增加出現(xiàn)過早退變的生物學特征。

本研究的細胞生長曲線圖顯示隨著傳代次數(shù)的增加，細胞的增值峰也逐漸降低，2代細胞較4和6代細胞具有更好的分化能力。這種OA軟骨細胞增殖特性提示我們4代以內(nèi)的細胞可能是用于實驗研究的選擇范圍。

總之，本實驗采用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法可成功從體外分離出骨關節(jié)炎軟骨細胞，2代的骨關節(jié)炎軟骨細胞具有高增值峰，4代以內(nèi)的軟骨細胞表型穩(wěn)定，生長良好。這種OA軟骨細胞增殖特性提示我們2或3代軟骨細胞是用于實驗研究的最佳選擇，為進一步研究人軟骨細胞的其他生物學特性及骨關節(jié)炎的發(fā)病機制提供了實驗基礎。本研究的不足之處在于沒有使用正常關節(jié)軟骨細胞進行對照研究。

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The Biological Characteristics of Chondrocytes from Osteoarthritis Patients in Vitro

Tang Xin，Zheng Guo，Huang Qiang，etal

(Department of Orthopaedics，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041)

Objective To study the methods for isolation，culture and identification of articular chondrocytes as well as the biological characteristics from osteoarthritis patients in vitro.Methods Cartilage was harvested under sterile conditions from osteoarthritis knee joints in total knee arthroplasty.Human articular chondrocytes were isolated by using two-step enzymatic digestion，and the cells were cultured and subcultured respectively in vitro.Cell morphology were observed under phase-contrast microscope，toluidine blue staining，type Ⅱ collagen immunohistochemistry staining and growth curve was drawn.Results The morphology of osteoarthritis chondrocytes was similar to fibroblasts，and the growth rate was slowly.It could get a confluent layer after culture for about two weeks and appeared distinct differentiation in passage four.Toluidine blue staining and type Ⅱ collagen immunohistochemistry staining showed that the chondrocytes cultured in vitro maintained the specific chondrocytes phenotype in the first 4 passages.Conclusion Within 4 passages，the osteoarthritis chondrocytes grew well with obviously biological characteristics and turned to dedifferentiation after 4 passages.

osteoarthritis；human chondrocytes；cytology

國家青年自然基金項目(81101388)；*本文通訊作者：李箭

1008-5572(2015)07-0614-05

R684.3

A

2015-01-21

唐新(1980- )，男，主治醫(yī)師，四川大學華西醫(yī)院骨科，610041。