骨肉瘤患者血清miR-21的表達(dá)意義及其與化療藥物敏感性的研究

吳子晏，劉洋，楊述華

(1.武漢市第五醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430050；2.武漢協(xié)和醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430022)

臨床研究

骨肉瘤患者血清miR-21的表達(dá)意義及其與化療藥物敏感性的研究

吳子晏1，劉洋1，楊述華2

(1.武漢市第五醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430050；2.武漢協(xié)和醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430022)

目的 本研究通過檢測骨肉瘤患者血清中miR-21的表達(dá)水平，分析其在化療前后的變化，研究血清miR-21的表達(dá)與化療藥物敏感性之間的關(guān)系。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測38 例骨肉瘤患者(肺部轉(zhuǎn)移患者17 例)化療前后血清中miR-21的表達(dá)水平，分析血清miR-21表達(dá)水平與骨肉瘤患者臨床病理特征之間以及與化療藥物敏感性之間的關(guān)系。結(jié)果 與健康對照組表達(dá)量0.23相比，血清miR-21在骨肉瘤患者中的表達(dá)量為5.68，表達(dá)水平明顯上調(diào)(P=0.007)；有肺部轉(zhuǎn)移的患者血清中miR-21的表達(dá)量為7.26，高于無肺部轉(zhuǎn)移的患者表達(dá)量2.32，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)；血清miR-21與對應(yīng)腫瘤組織miR-21的表達(dá)呈正相關(guān)(rho=0.712，P<0.001)；而且本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-21水平在化療無效者為7.65，明顯高于化療有效者2.75，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)論 高表達(dá)的miR-21水平與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)聯(lián)，血清miR-21表達(dá)與骨肉瘤化療療效密切相關(guān)，其可以作為潛在的生物標(biāo)記物用于骨肉瘤早期診斷及化療敏感性預(yù)測，且可以作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

骨肉瘤；血清；miR-21；化療敏感性

骨肉瘤是一種常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，由于其生長快、病程短、易早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，危害性大，死亡率高，隨著新型輔助化療和手術(shù)治療的開展，其5年存活率已經(jīng)由不超過20%升至60%以上[1]。但由于化療抵抗的產(chǎn)生和化療藥物的不良反應(yīng)，骨肉瘤的治療效果仍不盡人意，目前還缺少一種特異標(biāo)記物，能用于骨肉瘤早期診斷、預(yù)后判斷和指導(dǎo)治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 來自華中科技大學(xué)協(xié)和醫(yī)院骨科和腫瘤科2012年4月至2014年2月收治的骨肉瘤患者38 例(肺部轉(zhuǎn)移患者17 例)，其中男性24 例，女性14 例，年齡14～62 歲(中位年齡25 歲)。均留取手術(shù)前化療前后1 d空腹血清標(biāo)本(化療T12方案，甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑和異環(huán)磷酰胺)，腫瘤組織臨床分期參照Enneking分期法。全部病例均經(jīng)臨床、X線片、病理組織學(xué)檢查證實(shí)。手術(shù)標(biāo)本用4%的甲醛溶液固定24 h后，按常規(guī)石蠟包埋技術(shù)進(jìn)行骨肉瘤石蠟標(biāo)本的制作，用于病理學(xué)觀察和miR-21基因檢測。健康對照組10 例，男性5 例，女性5 例，年齡在11到30 歲之間，平均年齡19 歲。均取空腹血清標(biāo)本。

1.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)檢測miR-21的表達(dá) a)組織和血清總RNA提?。簢?yán)格按照TaqMan miRNA Isolation Kit(加拿大Applied Biosystems公司)提取分離試劑盒說明書步驟進(jìn)行，用核酸蛋白分析儀檢測提取RNA的濃度和純度。OD260/OD280均在1.8～2.0。b)miRNA莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄：應(yīng)用TaqMan microRNA assay和TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(加拿大Applied Biosystems公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min。利用TaqMan Universal PCR Master Mix(加拿大Applied Biosystems公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃10 min；95℃15s；60℃60s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct公式計(jì)算miR-21相對表達(dá)量[2]，以U6作為內(nèi)參基因。

1.3 手術(shù)前化療后腫瘤組織壞死分級[3]Ⅰ級：腫瘤壞死很少或無壞死，壞死小于等于50%；Ⅱ級：腫瘤部分壞死，大于50%但小于90%，偶見疏松纖維組織增生，仍見區(qū)域性存活腫瘤；Ⅲ級：絕大部分區(qū)域腫瘤壞死，大于等于90%但小于等于99%，僅見散在存活腫瘤細(xì)胞灶；Ⅳ級：100%腫瘤壞死，無存活腫瘤細(xì)胞，可見纖維組織增生。Ⅰ級和Ⅱ級可認(rèn)為化療無效，Ⅲ級和Ⅳ級可認(rèn)為是化療有效。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較了患者年齡，性別，化療反應(yīng)與腫瘤組織和血清miR-21的表達(dá)相關(guān)性；用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較了腫瘤位置，Enneking分期與腫瘤組織和血清miR-21的表達(dá)相關(guān)性，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清miR-21的表達(dá) 血清miR-21在骨肉瘤患者和正常對照組中均有表達(dá)，在骨肉瘤患者中miR-21的表達(dá)量為5.68，而在正常對照組中表達(dá)量為0.23，兩者差異顯著(P<0.001)；且在肺部轉(zhuǎn)移患者血清中miR-21的表達(dá)量為7.26，高于無肺部轉(zhuǎn)移患者表達(dá)量2.32，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。

2.2 血清miR-21的表達(dá)與患者臨床病例特征的關(guān)系 骨肉瘤患者血清miR-21的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑和Enneking分期無關(guān)(P>0.05)(見表1)；且血清miR-21與對應(yīng)腫瘤組織miR-21的表達(dá)呈正相關(guān)(rho=0.712，P<0.001)。

2.3 血清miR-21的表達(dá)與療效的關(guān)系 化療有效組，骨肉瘤患者血清miR-21表達(dá)水平由化療前7.65降至化療后的3.14，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；化療無效組，骨肉瘤患者血清miR-21表達(dá)水平由化療前2.45降至化療后的1.84，兩者無明顯變化(P>0.05)；且化療前化療有效組血清miR-21表達(dá)水平與化療無效組差異顯著(P<0.001)。

表1 miR-21的表達(dá)和一般臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)骨惡性腫瘤，很多患者在確診時(shí)已出現(xiàn)了肺部轉(zhuǎn)移，肺部轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者死亡的一個(gè)主要原因，盡管患者5年生存率有明顯的改善，但是近20年，即使經(jīng)過國際諸多研究機(jī)構(gòu)的大量努力，骨肉瘤生存率依然沒有明顯變化。究其原因骨肉瘤化療后出現(xiàn)多藥耐藥是一個(gè)主要因素。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞被一種藥物誘發(fā)耐藥后，同時(shí)對其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的藥物產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象[4]，這是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程。癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性決定了抗癌的有效性。因此，迫切需要尋找理想的腫瘤標(biāo)志物提高骨肉瘤患者的早期診斷率，監(jiān)測患者化療的療效、實(shí)時(shí)檢測個(gè)體化化療相關(guān)標(biāo)志并據(jù)此選擇化療方案。

由于循環(huán)中腫瘤細(xì)胞、血清和血漿均攜帶腫瘤組織信息，為實(shí)時(shí)個(gè)體化檢測提供了新的檢測來源，目前循環(huán)miRNA在腫瘤診斷和預(yù)后判斷方面已顯示出卓越性能，如Hu等[5]發(fā)現(xiàn)血清miR-486、miR-30 d、miR-1和miR-499表達(dá)水平能作為肺癌患者預(yù)后的一個(gè)強(qiáng)有力指標(biāo)。

miR-21是miRNAs家族中的一員，其不僅與腫瘤發(fā)生有關(guān)，還可通過作用于多種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因影響腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵入。Zhu等[6]證實(shí)通過減少miR-21的表達(dá)而導(dǎo)致TMPI、PDCD4和maspin表達(dá)的上調(diào)，從而使得乳腺癌NDA-MB-231細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移和侵入的概率明顯減少。Wu等[7]發(fā)現(xiàn)miR-21在骨肉瘤中高表達(dá)，且miR-21通過調(diào)控RECK的表達(dá)，影響骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。最近研究已表明miR-21的表達(dá)和藥物耐受有一定的關(guān)聯(lián)。miR-21在乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，上調(diào)或下調(diào)miR-21可影響乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性[8]。Li等[9]發(fā)現(xiàn)在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)的miR-21能導(dǎo)致細(xì)胞對多種化療藥物產(chǎn)生耐受，而降低miR-21的能增強(qiáng)細(xì)胞的敏感性；Hwang等[10]在回顧性研究miR-21和化療效果及胰腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)經(jīng)化療后miR-21低表達(dá)的患者有著更高的無瘤生存率，降低miR-21能提高對化療藥物的敏感性。

本研究檢測了38 例骨肉瘤患者及正常對照組血清中的miR-21表達(dá)水平，結(jié)果顯示血清miR-21表達(dá)量明顯高于對照組，提示外周血miR-21可能是一種較好作為骨肉瘤早期診斷有關(guān)的腫瘤標(biāo)記物；此外，miR-21表達(dá)與骨肉瘤患者年齡、性別、部位、大小、TNM分期無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，但是有肺部轉(zhuǎn)移患者miR-21的表達(dá)水平高于無轉(zhuǎn)移患者，說明miR-21與腫瘤轉(zhuǎn)移之間存在一定的相關(guān)性。而肺部轉(zhuǎn)移是骨肉瘤治療失敗和患者死亡的一個(gè)重要原因。Yuan等[11]研究也證實(shí)血漿miR-21與骨肉瘤患者生存率之間存在明顯關(guān)聯(lián)。在腫瘤組織中miR-21的表達(dá)和血清中的表達(dá)成正相關(guān)，提示血清miR-21的表達(dá)水平在一定程度上能反映腫瘤組織中的表達(dá)水平。而且本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-21水平在化療無效者明顯低于化療有效者，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明血清miR-21水平可能與化療敏感性相關(guān)。Asaga等[12]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者中血清miR-21可以作為一個(gè)潛在的診斷和預(yù)后指標(biāo)；Wang等[13]研究證實(shí)血清miR-21表達(dá)越高的非小細(xì)胞肺癌患者有著更高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和更短生存期；在前列腺癌中，血清miR-21被發(fā)現(xiàn)可以作為多西他賽藥物化療敏感的一個(gè)指標(biāo)[14]。下一步我們將深入探索化療抵抗的一些具體機(jī)制，并聯(lián)合檢測其他相關(guān)的一些miR，以期發(fā)現(xiàn)更多血清腫瘤分子標(biāo)記物在骨肉瘤診斷中的作用及與化療藥物敏感性的聯(lián)系。

綜上所述，高表達(dá)的miR-21水平與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)聯(lián)，血清miR-21表達(dá)與骨肉瘤化療療效密切相關(guān)，其可以作為潛在的生物標(biāo)記物用于骨肉瘤早期診斷及化療敏感性預(yù)測，且可以作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

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Serum miR-21 Expression and Its Correlation with Chemosensitivity in Osteosarcoma

Wu Ziyan1，Liu Yang1，Yang Shuhua2

(1.Department of Orthopaedics，F(xiàn)ifth Hospital of Wuhan；2.Department of Orthopaedics，Union Hospital of Wuhan，430050，China)

Objective To investigate the correlation between serum miR-21 and chemosensitivity by detecting the expression of serum miR-21 of patients with osteosarcoma and analyze its change before and after chemotherapy.Methods We examed the level of serum miR-21 expression in 38 osteosarcoma patients(17 patients with lung metastasis)before and after chemotherapy by real-time RT-PCR and evaluated the clinical relevance and the correlation between chemosensitivity and miR-21.Results The expression level of serum miR-21 was higher in osteosarcoma patients(5.68)than in healthy people(0.23)(P=0.007)and the expression of miR-21 in lung metastasis patients(7.26)increased obviously compare to non-lung metastasis(2.32)(P=0.023).And the expression of serum miR-21 was closely correlated with corresponding miR-21 mRNA level in osteosarcoma tissues.Moreover，the expression of serum miR-21 was higher in non-effective chemotherapy samples(7.65)than that in effective chemotherapy samples(2.75)(P<0.001).Conclusion High expression of miR-21 correlates with lung metastasis and chemosensitivity in osteosarcoma patients.miR-21 in the peripheral blood may be used to diagnose osteosarcoma early and predict the chemosensitivity as a potential biomarker and miR-21 may be a potential therapeutical target for osteosarcoma patients.

osteosarcoma；serum；miR-21；chernosensitivity

武漢市衛(wèi)計(jì)委課題(WX13C34)

1008-5572(2015)07-0607-04

R73-3

A

2014-12-31

吳子晏(1978- )，男，主治醫(yī)師，武漢市第五醫(yī)院骨科，430050。