蘋果屬海棠親緣關(guān)系的AFLP分析

徐 曼，李厚華 ，郭亦博，趙 冰，王亞杰，高 艷

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2 內(nèi)蒙古阿里河林業(yè)局，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 165450)

蘋果屬海棠親緣關(guān)系的AFLP分析

徐 曼1，李厚華1，郭亦博2，趙 冰1，王亞杰1，高 艷1

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2 內(nèi)蒙古阿里河林業(yè)局，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 165450)

【目的】 在分子水平上探究蘋果屬海棠野生種、栽培種及相近屬植物之間的親緣關(guān)系，為分類學(xué)研究、海棠育種提供參考?！痉椒ā?選用4對AFLP引物(M-CTC/E-AGC,M-CTA/E-ACG,M-CAT/E-ACT和M-CAA/E-ACG),分析蘋果屬海棠9個(gè)野生種、8個(gè)栽培種以及4個(gè)山楂屬植物和2個(gè)梨屬植物的遺傳多樣性。【結(jié)果】 (1)共擴(kuò)增出條帶114條,其中多態(tài)性條帶108條,多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)94.7%，供試材料表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。(2)供試材料在相似系數(shù)為0.73時(shí)被分為3組，分別為蘋果屬組、山楂屬組和梨屬組，因此AFLP分子標(biāo)記的方法可以將蘋果屬與梨屬、山楂屬完全區(qū)分開。(3)秦巴山區(qū)野生蘋果屬海棠在相似性系數(shù)為0.80時(shí)被聚為4組，聚類結(jié)果支持Rehder將湖北海棠和垂絲海棠列入山荊子系的分類方法，不支持Langenfelds建立獨(dú)立的湖北海棠系的分類方法?！窘Y(jié)論】 基于遺傳相似性系數(shù)的聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果基本一致，既驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)分類的正確性，又解決了各分類系統(tǒng)間存在的分歧。

海棠；AFLP；分子標(biāo)記；親緣關(guān)系；分類

海棠是蘋果屬(Malus)多種植物和木瓜屬(Chaenomeles)幾種植物的通稱。蘋果屬海棠(crabapple)，是指蘋果屬具較小果實(shí)(直徑≤5 cm)的類型。蘋果屬海棠既可作為重要的觀賞花木，又具有食用價(jià)值和藥用價(jià)值，如垂絲海棠(M.halliana)、西府海棠(M.micromalus)等具有優(yōu)良的觀賞性狀，常用于園林綠化；湖北海棠葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，可制成保健茶等[1]。

以往對蘋果屬的分類，主要依據(jù)形態(tài)標(biāo)記，如葉形、果形、嫩枝絨毛、葉緣鋸齒、萼片宿存與否等[2]。由于蘋果屬植物具有多型性，形態(tài)特征不能充分解決蘋果屬種系分類問題。因此，試驗(yàn)研究成為蘋果屬植物分類與系統(tǒng)演化關(guān)系研究的重要依據(jù)[3]。對蘋果屬植物分類學(xué)的研究主要包括細(xì)胞分類學(xué)、孢粉學(xué)、植物化學(xué)分類學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)等。分子系統(tǒng)學(xué)作為最新的分類手段之一，常用的分析技術(shù)有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、ITS等，其中AFLP分子標(biāo)記技術(shù)是一種建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的DNA指紋分析技術(shù),其多態(tài)性豐富,使得從基因組水平探討蘋果屬種間、組系間及與相近屬間的親緣關(guān)系成為可能[4]。AFLP標(biāo)記在種下水平的遺傳多樣性研究中也發(fā)揮著重要作用，已被廣泛用于龍眼品種(系)、梨新品種、山東石榴品種的遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究[5-7]。

運(yùn)用分子技術(shù)對蘋果屬的分類研究主要有：梁國魯?shù)萚8]用AFLP技術(shù)對該屬23個(gè)種共31個(gè)類型的分析，印證了傳統(tǒng)分類研究的結(jié)論，明確了佛羅倫薩海棠等疑難種的分類地位；石勝友等[9]利用AFLP標(biāo)記對變?nèi)~海棠、隴東海棠、花葉海棠的親緣關(guān)系進(jìn)行分析, 結(jié)果與形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和同工酶的結(jié)果一致,在分子水平上揭示了變?nèi)~海棠的雜種起源；郭翎等[10]通過AFLP技術(shù)得出亞洲原產(chǎn)的蘋果屬植物對于蘋果及觀賞海棠品種的發(fā)展起重要作用的結(jié)論，并建議將原屬花楸組植物除佛羅倫薩蘋果外全部并入蘋果組，取消脫萼組，將其組內(nèi)的植物全部并入蘋果組。

蘋果屬分類系統(tǒng)繁多，分類系統(tǒng)間存在差異。本研究運(yùn)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)和聚類分析方法，探究分布于秦巴山區(qū)的野生海棠種質(zhì)資源、常見海棠栽培種及其相近屬植物材料之間的親緣關(guān)系，以期為分類學(xué)研究提供依據(jù)，為培育海棠新品種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

植物材料采集于秦巴山區(qū)、陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)博覽園、北京植物園、中國科學(xué)院植物所、河北懷柔、陜西府谷。其中，山荊子、湖北海棠、垂絲海棠、三葉海棠、變?nèi)~海棠、隴東海棠、河南海棠、滇池海棠為野生種，而平邑甜茶、八棱海棠、西府海棠、花紅、楸子、海棠花、海紅果為常見的栽培種[11]。于2012-07采集無病蟲害的幼嫩葉片，用變色硅膠干燥后，保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。供試材料編號(hào)及來源見表1。

續(xù)表1 Continued table 1

1．2 方 法

1．2．1 DNA提取 采用植物基因組DNA試劑盒(天根，北京)提取各試驗(yàn)材料的基因組DNA。將提取的DNA用1.5 g/L瓊脂糖凝膠檢測純度。采用紫外分光光度計(jì)(六一，北京)，選DL2000 DNA作為對照來估計(jì)DNA濃度。之后稀釋每個(gè)樣品至50 ng/μL，-20 ℃保存。

1．2．2 AFLP分析 采用Vos等[12]的方法并稍作改動(dòng)對樣品進(jìn)行AFLP分析。反應(yīng)程序如下：從23個(gè)樣品的基因組DNA中分別取5 μL 于37 ℃ 酶切連接3 h(內(nèi)切酶采用EcoRⅠ和MseⅠ)，將得到的DNA模板用于預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增采用MseⅠ+C/EcoRⅠ+A引物組合，預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性30 s,56 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min, 進(jìn)行24 個(gè)循環(huán)。對預(yù)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍稀釋，采用能產(chǎn)生清晰條帶的4種引物組合對稀釋的PCR產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增采用+3/+3引物組合，程序的第1步為13個(gè)循環(huán)(第1個(gè)循環(huán)94 ℃變性30 s,65 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min，接下來的12個(gè)循環(huán)，退火溫度每循環(huán)減少0.7 ℃)，第2步為24個(gè)循環(huán)( 94 ℃變性30 s,56 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min)。反應(yīng)結(jié)束后在 20 μL 反應(yīng)體系中加入 5 μL 加樣緩沖液，95 ℃變性8 min后迅速將 PCR管放于冰上以防止復(fù)性，然后將樣品置于-20 ℃冰箱保存用于電泳檢測。本試驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法進(jìn)行檢測。銀染后的板晾干后在 X 線膠片觀察燈下觀察。

1．2．3 聚類分析 對擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果采用“0-1”系統(tǒng)記錄譜帶位置，觀察電泳圖譜中同一位置上DNA條帶的有無，有記為1，無記為0，形成0/1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。采用多變量分析系統(tǒng)(NTSYS2pc,2.10版) 軟件中的DICE法計(jì)算遺傳相似系數(shù),然后根據(jù)相似系數(shù)用SAHN Clustering和非加權(quán)組平均法(UPGMA) 進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增片段的多態(tài)性

從選擇性引物組合中,篩選出擴(kuò)增條帶豐富、分辨能力強(qiáng)的引物對,分別為M-CTC/E-AGC、M-CTA/E-ACG、M-CAT/E-ACT、M-CAA/E-ACG。引物M-CAA/E-ACG組合對供試樣本的AFLP擴(kuò)增圖譜見圖1。

圖1 引物M-CAA/E-ACG組合對供試植物樣本的AFLP擴(kuò)增圖譜
M.Takara DL2000 DNA Marker；1～23.材料編號(hào)同表1
Fig.1 AFLP fingerprinting patterns using M-CAA/E-ACG
M.DL2000 DNA Marker (Takara)；1-23.The serial numbers of samples are the same as Table 1

用這4對引物對供試材料的基因組進(jìn)行擴(kuò)增,共擴(kuò)增出條帶114條, 其中多態(tài)性條帶108條。平均每對引物擴(kuò)增出條帶28.5條,多態(tài)性條帶平均為27條,多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)94.7%(表2)?？梢?供試材料間在分子水平上酶切位點(diǎn)的分布具有廣泛的差異,其遺傳多樣性極為豐富。

表2 4對AFLP選擇性擴(kuò)增引物產(chǎn)生的條帶多態(tài)性Table 2 Polymorphism of AFLP bands obtained by selective amplification based on the 4 primer pairs

2.2 遺傳多樣性聚類分析

在用于AFLP分析的引物組合中，根據(jù)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳所得的大量清晰條帶，從中選取108條多態(tài)性條帶，進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算后，再經(jīng)過聚類分析，構(gòu)建了23份供試材料的親緣關(guān)系樹狀圖(圖2)。這23份材料的相似系數(shù)介于0.68～0.94，根據(jù)相似性關(guān)系，在相似系數(shù)為0.73時(shí)，可以將這些材料分為3個(gè)組：Ⅰ.梨屬組，包括白梨和沙梨；Ⅱ.山楂屬組，包括裂葉山楂、山楂、遼寧山楂、野山楂；Ⅲ.蘋果屬組，包括所有的蘋果屬野生種以及栽培種(圖2)。

圖2 23個(gè)供試植物樣本AFLP分析親緣關(guān)系樹狀圖Fig.2 Dendrogram of 23 samples based on AFLP data

選取海棠野生種樣本的相似性系數(shù)進(jìn)行聚類分析,得到野生種親緣關(guān)系樹狀圖(圖3)。在相似性系數(shù)為0.80處，可將這些采自秦巴山區(qū)的野生蘋果屬海棠聚為4組：Ⅰ組為山荊子系，包括湖北海棠、垂絲海棠和山荊子；Ⅱ組為三葉海棠系，包括三葉海棠；Ⅲ組為隴東海棠系，包括變?nèi)~海棠、隴東海棠；Ⅳ組為滇池海棠系，包括滇池海棠和河南海棠(圖3)。

試驗(yàn)中的栽培種包括平邑甜茶、八棱海棠、西府海棠、花紅、楸子、海棠花、海紅果等，這些栽培種沒有野生種的自然分布區(qū)，盡管存在著一些栽培種的親本記載，但其親本尚存在不確定性。試驗(yàn)表明，這些栽培種均可以與中國的野生海棠聚類在一起(圖2)。

圖3 海棠野生種AFLP 分析親緣關(guān)系樹狀圖Fig.3 Dendrogram of wild crabapple species based on AFLP data

3 討 論

3.1 蘋果屬與梨屬、山楂屬的親緣關(guān)系

蘋果最早歸梨屬，英國植物學(xué)家Miller將Linnaeus[13]定名的蘋果從梨屬中獨(dú)立出來[14]，成立了蘋果屬。德國學(xué)者Borkhausen將原已定入梨屬中的4個(gè)種納入蘋果屬，改名為M．baccata(L.) Borkh(山荊子)、M．praecox(Pall.) Borkh(道生蘋果)、M.prunifolia(Willd.) Borkh(楸子)、M.spectabilis(Air.) Borkh(海棠花)[15]。然而，根據(jù)蘋果屬與梨屬和山楂屬形態(tài)特征存在的相似性及其在全球范圍分布帶的多相重復(fù)性，可以推斷出蘋果屬與梨屬和山楂屬存在著共祖關(guān)系[15]。目前蘋果屬植物出現(xiàn)中間雜種的事實(shí)也反映了他們之間有較近的親緣關(guān)系。

本試驗(yàn)采用AFLP技術(shù)，從DNA角度對3個(gè)屬的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋果屬、山楂屬(裂葉山楂、山楂、遼寧山楂、野山楂)、梨屬(白梨和沙梨)材料在相似性系數(shù)為0.73處被聚類在3個(gè)不同的組，表明雖然蘋果屬與梨屬和山楂屬親緣關(guān)系較近，但用分子標(biāo)記的方法可以將蘋果屬與梨屬、山楂屬完全區(qū)分開，支持了前人依據(jù)形態(tài)學(xué)特征對蘋果屬、梨屬、山楂屬分類的科學(xué)性，也進(jìn)一步證明了將AFLP分子標(biāo)記用于植物分類的可行性。

3.2 海棠野生種的親緣關(guān)系

秦巴山區(qū)作為我國重要的植物種質(zhì)資源分布中心，其海棠資源主要有以下幾種：山荊子、湖北海棠、垂絲海棠、三葉海棠、變?nèi)~海棠、隴東海棠、河南海棠、滇池海棠[16]。根據(jù)Rehder[17]對蘋果屬植物的分類，這些野生種可被分為4個(gè)系：山荊子系(山荊子、湖北海棠和垂絲海棠)、三葉海棠系(三葉海棠)、隴東海棠系(變?nèi)~海棠、隴東海棠)和滇池海棠系(河南海棠、滇池海棠)。

Rehder分類系統(tǒng)將山荊子、湖北海棠、垂絲海棠都列在山荊子系(Ser.Baccatae)，而之后Langenfelds[18]的分類系統(tǒng)主張將多型性發(fā)達(dá)的湖北海棠種提升為湖北海棠系(Ser.Hupehenses)。李育農(nóng)[11]支持Langenfelds的主張，新建了湖北海棠系，包含湖北海棠和垂絲海棠2個(gè)種。

本研究結(jié)果表明，湖北海棠首先與山荊子聚在一起，然后二者再與垂絲海棠聚在一組，因此，根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不能將湖北海棠系(湖北海棠、垂絲海棠)與山荊子系分開。本研究結(jié)果支持Rehder將湖北海棠和垂絲海棠列在山荊子系的分類方法，不支持Langenfelds建立獨(dú)立的湖北海棠系的分類方法。

本研究根據(jù)AFLP分子標(biāo)記對上述野生種的聚類分析結(jié)果與Rehder的形態(tài)學(xué)分類基本一致，僅滇池海棠的聚類存在差異，滇池海棠沒有與河南海棠聚在一起，反而與隴東海棠和變?nèi)~海棠聚在一起，與Rehder的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果有所差別。但是與Huckins[19]在Rehder分類系統(tǒng)上進(jìn)行調(diào)整的結(jié)果一致，Huckins將隴東海棠系(Ser.Kansuenses)與滇池海棠系(Ser.Yunnanenses)合并。

3.3 海棠栽培種的親緣關(guān)系

Rehder[17]根據(jù)形態(tài)學(xué)特征推斷，西府海棠可能是由山荊子和海棠花雜交而成。由本次聚類結(jié)果可以看出，西府海棠與山荊子和花紅聚類在一起，而與海棠花的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此推斷西府海棠可能是由山荊子和花紅雜交而成。從地理起源方面看，西府海棠起源于西府，在歷史上位于陜西的寶雞市被稱作西府，而花紅同樣起源于西北地區(qū)，在寶雞周圍的秦嶺山區(qū)有大片分布區(qū)，因此花紅作為西府海棠親本的可能更大。

在蘋果屬植物中，常存在同名異物和同物異名的現(xiàn)象，容易引起混淆，還需要進(jìn)一步研究統(tǒng)一。根據(jù)中國植物志記載，西府海棠果皮紅色[2]，而陜西西府海棠果皮黃色，通過對中國科學(xué)院植物所西府海棠(中國植物志所用樣本)和陜西西府海棠親緣關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，二者相似性系數(shù)接近于1，應(yīng)為同一個(gè)栽培種。因此，建議將果皮黃色納入西府海棠的描述中。

綜上所述，利用AFLP分子標(biāo)記方法進(jìn)行野生植物的親緣關(guān)系研究，補(bǔ)充了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法的不足，得出以下結(jié)論：1)本研究可以將蘋果屬與梨屬、山楂屬完全區(qū)分開，也證明了前人依據(jù)形態(tài)學(xué)特征對蘋果屬、梨屬、山楂屬分類的科學(xué)性；2)蘋果屬內(nèi)的聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類基本一致，并且能解決不同形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)間存在差異的問題，如聚類結(jié)果支持Rehder將湖北海棠和垂絲海棠列入山荊子系的分類方法，不支持Langenfelds建立獨(dú)立的湖北海棠系的分類方法；3)海棠栽培種和野生種聚類分析結(jié)果表明，秦巴山區(qū)野生海棠種質(zhì)資源在海棠品種的培育中發(fā)揮著重要作用。另外，AFLP標(biāo)記為遺傳背景不清楚材料的父母本鑒定提供了一種可行的方法，它可以為新品種的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

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AFLP analysis on genetic relationship of crabapples

XU Man1,LI Hou-hua1,GUO Yi-bo2,ZHAO Bing1,WANG Ya-jie1,GAO Yan1

(1CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2ForestryAliheofInnerMongolia,Hulunbeier,InnerMongolia165450,China)

【Objective】 The study investigated the genetic relationship of wild crabapple species, popular cultivars and species of similar genus to provide theoretical support for taxonomic research and breeding new crabapple varieties.【Method】 By applying 4 pairs of AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) primers (M-CTC/E-AGC,M-CTA/E-ACG,M-CAT/E-ACT and M-CAA/E-ACG),9 samples of wild crabapples from Qinling Mountains,8 samples of common crabapple cultivars and 4Crataegussamples,and 2Pyrussamples were selected for phylogenetic analysis.【Result】 (1) Four primer combinations produced a total of 114 fragments,among which 108 were polymorphic with a polymorphism ratio of 94.7%.(2) With a threshold value of 0.73,the 23 samples were clustered into 3 groups:genusMalus,CrataegusandPyrus.Molecular markers method was successful to separate genusMalus,CrataegusandPyrus.(3) With a threshold value of 0.80,the wild species of Qinling Mountains were clustered into 4 groups.The clustering result was in line with traditional morphological classification,which groupedM.hupehensisandM.hallianato SerialBaccataeRehd instead of a separate Ser.HupehensesLangenf. 【Conclusion】 Clustering based on genetic similarity coefficients was basically in line with morphological classification,which not only verified the correctness of the morphological classification,but also solved the existing differences between various classification systems.

crabapples;AFLP;molecular markers;relationship;classification

2014-01-21

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201204308)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20120204120006)

徐 曼(1989-)，女，河南淮濱人,在讀碩士，主要從事園林植物分類研究。E-mail：843338466@qq.com

李厚華(1973-),男，山東梁山人，副教授，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：lihouhua73@163.com

時(shí)間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.012

S685.99

A

1671-9387(2015)08-0159-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.012.html