秦川牛ADIG基因重組腺病毒過表達載體的構(gòu)建與病毒包裝

張 瓊，姜碧杰，成 功，劉 揚，昝林森,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

秦川牛ADIG基因重組腺病毒過表達載體的構(gòu)建與病毒包裝

張 瓊1，姜碧杰1，成 功1，劉 揚1，昝林森1,2

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

【目的】 構(gòu)建秦川牛ADIG基因的重組腺病毒載體，包裝并擴繁病毒，為下一步研究該基因在脂肪細胞分化過程中的分子作用機制和相關(guān)信號通路奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?根據(jù)NCBI收錄的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列設(shè)計引物，以秦川牛組織樣提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為模板，通過RT-PCR和PCR擴增獲得目的基因，將其連接到pMD?19-T Simple載體并測序。質(zhì)粒提取純化后通過BglⅡ與SalⅠ雙酶切，然后膠回收酶切產(chǎn)物，將其連接到穿梭載體pAdTrack/CMV上，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack/CMV-ADIG。將pAdTrack/CMV-ADIG質(zhì)粒用PmeⅠ酶切線性化，轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的大腸桿菌 BJ5183感受態(tài)細胞中進行同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAD-ADIG，并用PacⅠ酶切鑒定，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10進行擴繁。用PacⅠ酶切線性化pAD-ADIG載體并回收質(zhì)粒大片段，轉(zhuǎn)染293A細胞進行病毒包裝，然后完成病毒擴繁和病毒滴度的測定。【結(jié)果】 PCR擴增獲得了399 bpADIG基因CDS區(qū)；成功構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack/CMV-ADIG和重組腺病毒質(zhì)粒pAD-ADIG。經(jīng)檢測，ADIG重組腺病毒包裝成功，擴繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)?！窘Y(jié)論】 成功構(gòu)建了秦川牛ADIG基因的重組腺病毒表達載體pAD-ADIG，完成了病毒包裝和擴繁。

ADIG；腺病毒；同源重組；秦川牛

Kim等[1]在小鼠脂肪組織基因芯片篩選中，發(fā)現(xiàn)了一個異于其他蛋白質(zhì)家族的潛在肥胖基因SMAF1，被稱為小脂肪細胞因子1(Small adipocyte factor 1)。該基因有0.7 kb轉(zhuǎn)錄本，編碼一個新的由80個氨基酸組成的10 ku跨膜蛋白，同源性檢測暗示該基因可能只在哺乳動物中存在。該基因編碼蛋白的N端富含亮氨酸，C末端富含酸性氨基酸，它的調(diào)控和表達暗示了這個新蛋白在脂肪細胞轉(zhuǎn)錄組中占據(jù)了獨特的地位，并且在脂肪組織的生理學(xué)和病理學(xué)方面起作用。SMAF1基因僅在脂肪細胞中特異性表達，在牛上被命名為ADIG。有研究表明[1]，在分離來自大鼠和小鼠上的原代脂肪前體細胞中該基因表達缺失；SMAF1基因表達與脂肪細胞基因表型呈現(xiàn)密切相關(guān)；不僅如此，SMAF1基因在脂肪細胞中的mRNA水平與脂肪細胞成熟分化程度呈正相關(guān)，但目前對SMAF1基因在脂肪細胞分化過程中所起的作用尚不清楚。本研究對秦川牛ADIG基因進行克隆，利用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建該基因的重組腺病毒表達載體，并對其進行了病毒包裝和擴繁，旨在為下一步研究該基因在秦川牛脂肪細胞分化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

腺病毒穿梭載體 pAdTrack/CMV、腺病毒骨架載體 pAdEasy-1均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院羅軍教授惠贈，質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司，大腸桿菌 Topl0、大量瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、LATaqDNA 聚合酶、KOD-Plus-Ver 2.0高保真酶、pMD?19-T Simple載體、T4 DNA ligase及限制性內(nèi)切酶BglⅡ、SalⅠ購自大連寶生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、超純瓊脂糖購自美國 Invitrogen 公司，限制性內(nèi)切酶PmeⅠ購自英國NEB公司，PCR引物由美國Invitrogen公司合成。

1.2 樣品采集

以國家肉牛改良中心飼養(yǎng)的秦川牛(2～3歲)為研究對象，屠宰后采集附睪脂肪組織，用DEPC水洗凈樣品表面殘留的血液及雜質(zhì)，迅速投入到液氮中保存，用于總RNA的提取。

1.3 總RNA的提取及cDNA模板的合成

利用Trizol法提取脂肪組織的總RNA，凝膠電泳檢測證實RNA的完整性較好，按照試劑盒說明將其反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA第一鏈。

1.4 秦川牛ADIG基因的克隆與測序鑒定

1.4.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI收錄的牛ADIG基因(GenBank登錄號：NM_001113720.1)的mRNA序列,運用Primer 5.0設(shè)計引物，上游引物添加BglⅡ酶切位點(下劃線)，下游引物添加SalⅠ酶切位點(下劃線)，并在兩端加上保護堿基，引物由南京金斯瑞公司合成。上游引物：5′-GGAAGATCTTAGCCACACACGCACCAT-3′，下游引物：5′-ACGCGTCGACCCAAAGTCCTCT-CCCCTC-3′。

1.4.2 完整編碼區(qū)(CDS)的克隆 以秦川牛組織樣提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-PCR,RT-PCR)技術(shù)，利用KOD-Plus-Ver 2.0高保真酶擴增目的基因的完整CDS區(qū)，反應(yīng)體系為：DNA 模板50 ng，1 U/μL KOD-Plus-Ver 2.0高保真酶0.4～0.6 μL，10×PCR Buffer 2 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，25 mol/L MgSO40.9～1.2 μL，上、下游引物各0.8 μL，補加ddH2O至總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min；98 ℃變性 12 s，60～53 ℃退火30 s(此處設(shè)置梯度退火目的是尋找最佳擴增效果的退火溫度)，68 ℃延伸 35 s，30個循環(huán)；68 ℃后延伸10 min，4 ℃冷卻10 min。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認片段大小是否與預(yù)期相符。

取擴增得到的PCR產(chǎn)物5 μL加入1 μL普通TaqDNA聚合酶，72 ℃加“A”反應(yīng)10 min。加“A”產(chǎn)物使用DNA凝膠回收試劑盒進行片段純化。

1.4.3 目的基因的亞克隆 將1.4.2節(jié)的PCR產(chǎn)物與pMD?19-T Simple載體于16 ℃反應(yīng)30 min后得到連接產(chǎn)物pMD-T-ADIG，連接體系為:pMD?19-T Simple 載體1 μL，PCR 回收產(chǎn)物1 μL，Solution Ⅰ 5 μL，加 ddH2O 至10 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TSS法制備的大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中，挑取經(jīng)菌落PCR初步鑒定呈陽性的單克隆進行搖菌，擴繁后參照Omega質(zhì)粒提取說明書提取質(zhì)粒，用BglⅡ和SalⅠ雙酶切鑒定正確后送西安Takara公司測序。

1.5 pAdTrack/CMV-ADIG質(zhì)粒的構(gòu)建

用BglⅡ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶對pMD-T-ADIG重組質(zhì)粒和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack/CMV分別進行雙酶切，瓊脂糖凝膠(0.8%)電泳檢測并進行膠回收。將酶切后的重組質(zhì)粒和腺病毒穿梭質(zhì)粒于16 ℃連接30 min，得到連接產(chǎn)物pAdTrack/CMV-ADIG，然后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中。將菌液均勻涂抹在含50 g/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)14～20 h，挑取單克隆擴繁后做菌液PCR鑒定，并提取陽性菌液質(zhì)粒，BglⅡ和SalⅠ雙酶切鑒定正確后送西安Takara公司測序。

1.6 重組腺病毒質(zhì)粒pAD-ADIG的構(gòu)建及測序鑒定

用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ將pAdTrack/CMV-ADIG質(zhì)粒線性化，轉(zhuǎn)入含有腺病毒骨架載體pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞中，將菌液均勻涂抹在含50 g/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20～30 h，挑取較小的菌落進行擴繁后提取質(zhì)粒，并利用PacⅠ內(nèi)切酶進行初步鑒定之后進行電泳檢測。由于BJ5183菌株屬于低拷貝菌種，因此將初步鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞中進行擴繁，菌液送西安Takara公司測序。測序正確的菌液進一步擴繁后，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，PacⅠ酶切線性化后用異丙醇沉淀法沉淀DNA片段，酶標(biāo)儀測定DNA濃度備用。

1.7 重組腺病毒質(zhì)粒pAD-ADIG的包裝與擴繁

用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提重組質(zhì)粒pAD-ADIG，測定質(zhì)粒濃度并取5 μg重組質(zhì)粒用PacⅠ酶切，然后膠回收大片段，用TurboFectTMinvitroTransfection Rengent 以每孔(6孔板)2 μg的量轉(zhuǎn)染匯合度為80%左右的293A細胞包裝病毒。轉(zhuǎn)染后每天在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光數(shù)量與分布情況并拍照，了解腺病毒包裝進程。用第1代病毒懸液侵染融合度為100%的293A細胞，按前述方法收集上清液，即為第2代病毒懸液。再用第2代病毒懸液侵染293A細胞，重復(fù)“侵染-凍融-收集”。收集高滴度病毒懸液，用綠色熒光蛋白(GEP)標(biāo)記法測定病毒滴度，具體步驟參考Lybarger等[2]及Hett等[3]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADIG基因CDS區(qū)的克隆結(jié)果鑒定

用KOD-Plus-Ver 2.0高保真酶選用梯度退火溫度的方法擴增ADIG基因CDS區(qū)，獲得了399 bp長度的目的片段；當(dāng)退火溫度為60 ℃時，目的基因擴增效果特異性好，雜帶明顯減少，同時目的基因條帶清晰明亮(圖1)。

圖1 秦川牛ADIG基因CDS區(qū)擴增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳檢測1～8.退火溫度依次為60,59,58，57，56，55，54,53 ℃下ADIG基因的擴增結(jié)果;9.DNA MarkerFig.1 Detection of CDS part of ADIG gene using agarose gel electrophoresis1-8.PCR products of ADIG gene under different annealing degrees (60，59，58，57，56，55，54，and 53 ℃);9.DNA Marker

2.2 pMD-T-ADIG質(zhì)粒的鑒定

用BglⅡ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶對pMD-T-ADIG載體雙酶切，獲得了約400 bp的目的片段。測序結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)其具有完整的CDS區(qū)，且無任何突變位點，進一步確定目的片段序列完好，可用于下一步穿梭載體的構(gòu)建。

2.3 pAdTrack/CMV-ADIG穿梭質(zhì)粒的鑒定

用BglⅡ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶對pAdTrack/CMV-ADIG載體雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別得到長度約為400和9 000 bp 2條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相一致，證明pAdTrack/CMV-ADIG穿梭載體構(gòu)建成功。

圖2 pAdTrack/CMV-ADIG穿梭質(zhì)粒的雙酶切鑒定1.DNA Marker;2～12.pAdTrack/CMV-ADIG載體BglⅡ和SalⅠ雙酶切結(jié)果 Fig.2 Dual enzyme digestion of pAdTrack/CMV-ADIG1.DNA Marker;2-12.Results of pAdTrack/CMV-ADIG digested by BglⅡ and SalⅠ

2.4 pAD-ADIG重組質(zhì)粒的鑒定

提取pAD-ADIG質(zhì)粒經(jīng)進行PacⅠ酶切鑒定，結(jié)果在4.5 kb處出現(xiàn)了目的條帶(圖3)，表明腺病毒重組成功。

圖3 pAD-ADIG重組腺病毒質(zhì)粒的PacⅠ酶切鑒定1～6.pAD-ADIG質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切結(jié)果;7.DNA MarkerFig.3 PacⅠdigestion of pAD-ADIG1-6. Results of pAD-ADIG digested with PacⅠ; 7.DNA Marker

2.5 重組腺病毒質(zhì)粒pAD-ADIG的包裝與擴繁

用PacⅠ酶切線性化pAD-ADIG重組腺病毒載體，回收DNA大片段并轉(zhuǎn)染293A細胞。轉(zhuǎn)染30 h，熒光倒置顯微鏡觀察，僅有少量的綠色熒光亮點(圖4-A)；轉(zhuǎn)染7 d，綠色熒光細胞明顯增多，視野變亮并在局部出現(xiàn)彗星狀熒光聚集，熒光分布最密集區(qū)域有些細胞開始變圓脫落(圖4-B)；轉(zhuǎn)染10 d，綠色熒光鋪滿整個視野，大量細胞病變脫落，出現(xiàn)明顯的空斑(圖4-C)，待約50%細胞脫落，收集細胞與培養(yǎng)液，得到第1代病毒懸液。重復(fù)“侵染-凍融-收集”擴繁得到高滴度病毒，用高滴度病毒侵染293A細胞(圖4-D)約30 h后有50%細胞病變變圓脫壁，收集病毒并測定病毒滴度。綠色熒光蛋白(GEP)標(biāo)記法的測定結(jié)果顯示，病毒滴度為1×108PFU/mL。

3 討 論

腺病毒載體是目前用于基因轉(zhuǎn)移最廣泛的載體之一,重組腺病毒感染譜廣、安全性高、容量大、體外可操作性好。目前常用的腺病毒載體系統(tǒng)主要包括ViraPowerTMAdenoviral Expression System及AdEasyTMAdenoviral Vector System等[4-5]。本試驗采用的是ViraPowerTM腺病毒系統(tǒng)，其特點是重組系統(tǒng)由2種質(zhì)粒組成，一種是包含有全部(或右側(cè)大部分)腺病毒基因組DNA的大質(zhì)粒(骨架質(zhì)粒)；另一種是小的穿梭質(zhì)粒，其帶有目的基因表達盒以及在表達盒兩側(cè)的與大質(zhì)粒上目的基因擬插入部位同源的序列[4-5]。

pAdEasy-1系統(tǒng)是首先將目的基因插入到穿梭載體(pAdTrack-CMV)中，然后用PmeⅠ酶切使之線性化，線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到含有骨架載體pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞中。穿梭質(zhì)粒與骨架載體的重組方式有2種，也正因為重組方式的不同，重組腺病毒質(zhì)粒PacⅠ酶切鑒定也顯示2種不同的結(jié)果，因此其條帶出現(xiàn)在4.5 kb處或是3.0 kb處都可認為其重組成功[6]。本試驗構(gòu)建過程中，檢測到的重組方式只有1種，酶切結(jié)果只顯示一種4.5 kb 的短片段(圖3)，沒有出現(xiàn)3.0 kb的短片段，也說明前一種重組方式更容易實現(xiàn)重組。在細菌中實現(xiàn)腺病毒載體的重組，然后提取重組腺病毒載體，用PacⅠ酶切線性化，回收質(zhì)粒大片段轉(zhuǎn)染293A細胞，包裝擴繁得到高滴度病毒[7]。

圖4 重組腺病毒質(zhì)粒pAD-ADIG的包裝與擴繁A.重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染30 h 的293A細胞，整個視野下僅有數(shù)個綠色熒光點(40×)；B.轉(zhuǎn)染7 d的293A細胞，綠色熒光細胞(GEP)明顯增多，局部出現(xiàn)彗星狀聚集(40×)；C.轉(zhuǎn)染10 d的293A細胞，綠色熒光細胞鋪滿整個視野，大量細胞病變變圓脫壁(40×)；D.高滴度腺病毒侵染30 h后的 293A細胞 (100×)Fig.4 Packaging and amplification of adenovirus A.Fluorescence microscopic image of 293A cells transfected after 30 h (40×);B.After 7 d,GEP positive 293A cells increased and showed a grapes-like gathering (40×);C.After 10 d,GEP positive 293A cells covered the entire field of vision, and most cells rounded off the wall (40×);D.30 h after infection of high titers adenovirus (100×)

由于ADIG(SMAF1)基因只能在成熟脂肪細胞中表達，這種組織特異性激起了國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究興趣。韓威等[8]研究發(fā)現(xiàn)，SMAF1基因在3T3-L1細胞中的異位表達能有效抑制3T3-L1細胞的增殖，而對細胞分化和凋亡未見有明顯的抑制作用。同時大量研究表明，脂肪細胞分化受多基因調(diào)控[9-20]，SMAF1基因在脂肪細胞中的mRNA水平與脂肪細胞成熟分化程度呈正相關(guān)。用TNF處理過的成熟脂肪細胞去分化后，引起了SMAF1表達的急劇下降，12 h后下降幅度更明顯。這種狀況是在PPARγ的表達水平下降后出現(xiàn)的，說明TNF介導(dǎo)的SMAF1的下降可能是通過PPARγ的作用實現(xiàn)的[21]。PPARγ在前體脂肪細胞中的異位表達能對脂肪細胞分化有明顯的促進作用[22]。日本學(xué)者研究表明，飼喂高脂肪日糧的小鼠，SMAF1的mRNA水平明顯提高[23]，這與提高PPARγ的表達后取得的效果相同，但是SMAF1基因也被發(fā)現(xiàn)能夠被視黃酸下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)該基因只在細胞膜上表達[23]，胞質(zhì)中沒有表達。另外，在日本和牛上所做的ADIG基因幾種不同脂肪組織的表達譜分析表明，含有脂肪多的組織ADIG基因表達量更高[24]。

本研究應(yīng)用腺病毒載體與目的基因進行體外連接，成功構(gòu)建了秦川牛ADIG基因的重組腺病毒過表達載體，并在293A細胞中包裝后進一步擴繁得到高滴度腺病毒，為下一步繼續(xù)研究該基因在脂肪細胞分化過程中的功能提供了理想的生物載體表達系統(tǒng)。

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Construction of recombinant adenovirus vector and viral packaging ofADIGgene in Qinchuan cattle

ZHANG Qiong1,JIANG Bi-jie1,CHENG Gong1,LIU Yang1,ZAN Lin-sen1,2

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2NationalBeefCattleImprovementCenterinChina,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The aim of this project was to construct recombinant adenovirus vector ofADIGgene,then package and amplify the corresponding recombinant adenovirus,which would improve further study on its molecular mechanism and related signaling pathway on adipocyte differentiation.【Method】 TheADIGgene was obtained by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and polymerase chain reaction (PCR),and the template was mixed cDNA from different tissues of Qinchuan cattle.Then PCR product was inserted to pMD?19-T Simple vector and confirmed by sequencing.The plasmids were prepared and then digested withBglⅡ andSalⅠ before gel extraction.The product was then inserted into the adenoviral shuttle plasmid pAdTrack/CMV to obtain pAdTrack/CMV-ADIG.The linearized plasmid pAdTrack/CMV-ADIG was co-transformed into competent cells BJ5183 containing adenoviral backbone plasmid pAdEasy-1 to obtain recombinant adenovirus vector pAD-ADIG.The recombinant adenovirus vector pAD-ADIG was verified by enzyme cleavage withPacⅠ.The confirmed recombinant adenovirus plasmid pAD-ADIG was transformed intoE.coliTop10 competent cells for further amplification.Plasmid of pAD-ADIG was then prepared and digested withPacⅠ to be totally linearized before being transfected into 293A cell line for packaging and amplification of the recombinant adenovirus. 【Result】 PCR product with length of 399 bp was obtained and the shuttle vector pAdTrack/CMV-ADIG together with the recombinant adenovirus vector pAD-ADIG were obtained and verified by sequencing.ADIGrecombinant adenovirus was packaged successfully and high concentration (1×108PFU/mL)ofADIGadenovirus was obtained.【Conclusion】 A recombinant adenovirus vector containingADIGgene was successfully constructed to package and amplify the recombinant adenovirus.

ADIG;adenovirus vector;homologous recombination;Qinchuan cattle

2014-01-17

國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2013ZX08007-002)；“十二五”國家“863”計劃項目(2013AA102505);國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛牦牛)產(chǎn)業(yè)體系專項(CARS-38)；國家自然科學(xué)基金項目(31272411)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2014KTZB02-02)

張 瓊(1990-)，女，陜西延長人，碩士，主要從事動物健康養(yǎng)殖研究。E-mail:zhangqiong232@163.com

昝林森(1963-)，男，陜西扶風(fēng)人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。 E-mail:zanlinsen@163.com

時間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.025

Q78；S823.8+1

A

1671-9387(2015)08-0033-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.025.html