利用貼牌水培法快速鑒定稗草對二氯喹啉酸的抗藥性水平

李巳夫, 唐 濤, 劉雪源, 劉都才, 柏連陽, 馬國蘭, 彭亞軍

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥研究所,長沙 410128;2.湖南省植物保護研究所,長沙 410125; 3.湖南省農(nóng)業(yè)科學院,長沙 410125)

利用貼牌水培法快速鑒定稗草對二氯喹啉酸的抗藥性水平

李巳夫1,2, 唐 濤2, 劉雪源2, 劉都才2, 柏連陽3*, 馬國蘭2, 彭亞軍2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)藥研究所,長沙 410128;2.湖南省植物保護研究所,長沙 410125; 3.湖南省農(nóng)業(yè)科學院,長沙 410125)

本文通過室內(nèi)貼牌水培法及整株法,快速鑒定并驗證了2013年采自湖南省不同地區(qū)稻田的50個稗草生物型對二氯喹啉酸的抗藥性,試驗結果表明：貼牌水培法所用的二氯喹啉酸甄別劑量為80 mg/L;稗草死亡率越低,其抗性倍數(shù)(resistance factor,RF)越高,其中死亡率為0時,整株法測定的RF值高達896.07～1 209.38;貼牌水培法測定的稗草樣本對二氯喹啉酸的ED50遠低于整株法,但兩種方法得到的不同稗草生物型對二氯喹啉酸的抗性水平趨勢高度吻合。筆者認為以貼牌水培法測定的死亡率小于40%的稗草樣本對二氯喹啉酸的抗性風險較高,值得深入研究。

稗草; 貼牌水培法; 二氯喹啉酸; 甄別劑量; 抗性倍數(shù)

稗草[Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.]是一種分布廣、危害重的惡性雜草,前期防除不當,易對水稻生產(chǎn)造成極大影響[1]。目前,我國水稻田稗草防除仍以化學防治為主,常用除稗劑為二氯喹啉酸(quinclorac)、五氟磺草胺(penoxsulam)、噁唑酰草胺(metamifop)、嘧啶肟草醚(pyribenzoxim)和氟吡磺隆(flucetosulfuron)[2-4]。其中,二氯喹啉酸作為經(jīng)濟、安全和有效的除稗劑品種之一[5-6],自1998年開始在湖南省推廣應用,但隨著連續(xù)、單一及隨意增加劑量等不科學使用,湖南地區(qū)的許多稗草生物型對二氯喹啉酸的抗藥性水平由敏感逐漸演變?yōu)楦呖筟7-9]。

現(xiàn)今,傳統(tǒng)的稗草抗藥性檢測手段主要有整株水平測定法(簡稱整株法、盆栽法)、器官或組織水平測定法、細胞或細胞器水平測定法和分子水平檢測方法等[10-14]。上述方法各有利弊,如整株法具有使用范圍廣及結果準確等優(yōu)點,但亦存在費力、占用空間大、周期長的缺點,而其他方法使用范圍窄且易受儀器條件限制。為此,建立一種簡便、快速鑒定稗草對除草劑的抗藥性水平方法,對于指導水稻田稗草防除乃至水稻的安全、高效生產(chǎn)至關重要。

植物水培是無土栽培模式下的一種重要方法,因其具有輕簡、便捷及快速等優(yōu)點,已被廣泛用于室內(nèi)科學研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐[15]。為便于獲得健壯且整齊一致的稗草植株,以及快速鑒定其對二氯喹啉酸的抗藥性水平,筆者結合實際情況設計了一套新穎的貼牌水培法,現(xiàn)將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試雜草：將2013年采集于湖南省不同地區(qū)稻田的232份稗草(E.crusgalli),按照地理位置劃分為湘東(長沙縣、寧鄉(xiāng)縣、望城區(qū))、湘北(常德市、沅江市)及湘中(湘潭縣、湘鄉(xiāng)縣)稻區(qū),并從上述樣本中隨機抽取50份(表1),快速鑒定其對二氯喹啉酸的抗藥性水平。

供試藥劑：50%二氯喹啉酸可濕性粉劑(江蘇快達農(nóng)化股份有限公司)。

儀器設備：生測噴霧塔(3WPSH-500E型),農(nóng)業(yè)部南京農(nóng)業(yè)機械化研究所;電子天平(FA1004B型、精確度10-4g、量程0～100 g),上海精密科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 貼牌水培法

種子萌發(fā)：將采回的成熟的稗草種子置于-25℃冰箱中儲存一個月,然后用0.25%硝酸鉀溶液于30℃浸泡1 d,撈出后以清水沖洗種子表面殘留的硝酸鉀溶液,最后將種子放在塑料杯中套袋、催芽(圖1a)。約3 d后種子萌發(fā)[16]。

營養(yǎng)液配制：取微量元素水溶肥料[肥萬稼通用型,Mn+Zn+Mo≥100 g/L,以色列昕爵國際集團(中國)生物有限公司]200μL,加水稀釋后配制成濃度為1.11μL/m L的營養(yǎng)液;試驗期間,每隔15 d換一次營養(yǎng)液。

表1 湖南省不同地區(qū)水稻田稗草樣本采集信息Table 1 Sampling information of Echinochloa crusgalli from rice fields at different areas in Hunan Province

續(xù)表1 Table 1(Continued)

幼苗定植：選取疏水的塑料標簽牌(長15 cm、寬5 cm、厚度0.05 cm),先在距離每塊標簽牌底部6 cm的位置貼一層雙面膠,然后貼上5根已萌發(fā)且生長一致的稗草幼苗(株高約6 cm且尚未至一葉一心期),并用透明膠帶固定幼苗(圖1b);最后將其放入1.11μL/mL營養(yǎng)液中培養(yǎng),保持幼苗根部浸入營養(yǎng)液中(圖1c)。

培養(yǎng)條件：溫度為(28±2)℃、光周期L∥D=14 h∥10 h、相對濕度(RH)為40%～60%,以下同。

1.2.2 貼牌水培法確定甄別劑量

甄別劑量是使敏感生物型的死亡率達95%以上的最低劑量。采用實驗室保存的稗草敏感生物型(感病對照),根據(jù)二氯喹啉酸的田間推薦劑量(500 mg/L),以10倍梯度設置系列劑量進行預試驗,然后逐漸縮小劑量范圍,多次重復試驗加以驗證,最后獲得該藥劑對稗草的甄別劑量。

1.2.3 貼牌水培法測定甄別劑量下稗草的死亡率

藥劑處理：待稗草幼苗長至兩葉期時,采用1.2.2得到的甄別劑量(80 mg/L二氯喹啉酸)處理,并以清水為對照。每個處理重復4次,每重復選用10株幼苗。將粘有幼苗的標簽牌置于含3.0 L二氯喹啉酸藥液的盒(長25 cm、寬15 cm、高15 cm)內(nèi),確保幼苗全部浸入藥液中(圖1d),30 min后取出,置于室內(nèi)晾干。

藥效調(diào)查：將晾干后的幼苗重新置于營養(yǎng)液中,置于溫室內(nèi)培養(yǎng)(圖1e),15 d后調(diào)查稗草死亡率。植株整體枯黃或者心葉枯死即視為死亡,而其他情況則視為存活。死亡率(%)=(幼苗死亡數(shù)/供試幼苗數(shù))×100。

1.2.4 整株法驗證不同死亡率區(qū)間稗草樣本對二氯喹啉酸的抗性

根據(jù)1.2.3的結果,選擇死亡率≤40%的全部稗草樣本,以及死亡率為41%～100%的部分稗草樣本,采用整株法驗證其對二氯喹啉酸的抗藥性水平。方法參照NY/T1155.4-2006[17]。

播種、定植：在塑料盆(d=9 cm)內(nèi)裝入風干、過篩(20目)、混勻后的沙土,每盆固定播種30粒已露白的稗草種子;待出苗后,定苗20株/盆。

藥劑配制：基于貼牌水培法的稗草死亡率,死亡率大于40%的稗草樣本組,配制5 g/L二氯喹啉酸,然后以5倍梯度依次稀釋成6個系列梯度濃度。死亡率小于等于40%的稗草樣本組,配制50 g/L二氯喹啉酸,再以5倍梯度依次稀釋成6個系列梯度濃度。

藥劑處理：待稗草苗長至3～4葉期,采用生測噴霧塔(工作壓=0.275 MPa)莖葉噴霧處理,噴液量450 L/hm2。每處理重復4次。

藥效調(diào)查：施藥后,詳細記錄稗草的受害癥狀,如生長抑制、葉片畸形和黃化等。處理后15 d,采用電子天平稱量稗草地上部分鮮重,計算鮮重抑制率、ED50及抗性倍數(shù)(resistance factor,RF)。

抗性倍數(shù)(RF)=整株法測定的ED50/同一試驗中整株法測定的ED50中最小的值

1.2.5 貼牌水培法測定二氯喹啉酸對不同死亡率區(qū)間稗草樣本的ED50

根據(jù)1.2.3的結果,分別從死亡率區(qū)間為81%～100%、61%～80%、41%～60%、21%～40%、1%～20%、0中各選取1個稗草樣本,采用貼牌水培法培養(yǎng)并測定其對二氯喹啉酸的ED50。

藥劑處理：試驗設6個濃度處理(基于貼牌水培法中稗草死亡率再確定具體濃度),每個處理重復4次,每個重復選取10株長勢一致的2葉期稗草幼苗。藥劑處理方法同1.2.3。

處理15 d后,用濾紙吸干取下的稗草樣本上的水分,稱量莖葉重量,計算并比較兩種方法測定的二氯喹啉酸對稗草的ED50,分析其相關性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2007與DPS V7.05的數(shù)量型數(shù)據(jù)分析法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,分別求出二氯喹啉酸對稗草樣本的回歸方程、相關系數(shù)、ED50及95%置信區(qū)間。

2 結果與分析

2.1 貼牌水培法甄別劑量確定及抗性水平篩選

貼牌水培法測定結果表明,當二氯喹啉酸劑量為60、70 mg/L時,稗草(敏感對照)死亡率分別為80%和90%,均低于95%;其劑量為80 mg/L時,稗草(敏感對照)死亡率接近100%;因此,將80 mg/L視為該藥劑對稗草的甄別劑量。以該劑量處理50份稗草樣本后15 d的死亡率結果如圖2所示。由圖2可知,死亡率≤40%的稗草樣本僅有9個,即編號01、04、10、23、32、37、44、45、50。

圖1 貼牌水培法主要操作步驟示意圖Fig.1 Schematic diagram of major steps for water culture method with label cards(WCMLC)

如以死亡率為標準,可以將其劃分為6個區(qū)間,即81%～100%、61%～80%、41%～60%、21%～40%、1%～20%和0,其對應的樣本數(shù)分別占總樣本數(shù)的48%、22%、12%、6%、6%和6%。

2.2 整株法驗證不同死亡率區(qū)間稗草樣本對二氯喹啉酸的抗性

選取貼牌水培法測得的9個疑似高抗的稗草樣本(死亡率≤40%)及其他不同抗藥性水平的6個樣本[編號06(死亡率100%,下同)、36(90%)、28(80%)、24(70%)、02(60%)、14(55.6%)],通過整株法進一步驗證其對二氯喹啉酸的抗藥性水平,結果表明：相對于06號敏感型稗草(ED50= 0.012 g/L),有46.67%(7/15)的稗草樣本對二氯喹啉酸已產(chǎn)生了極高水平的抗藥性,其RF值為210.09～1 209.38;20.00%(3/15)的稗草樣本對該藥劑存在較高水平的抗藥性,其RF值為95.83～119.86;6.67%(1/15)的稗草樣本表現(xiàn)為中等水平的抗藥性,其RF值為18.51;其余2個樣本對二氯喹啉酸仍保持較敏感水平,RF值為1.83～2.36(表2)。以上說明,貼牌水培法測定的稗草死亡率和整株法測出的稗草對二氯喹啉酸的RF值呈負相關。

圖2 二氯喹啉酸甄別劑量處理15 d后稗草死亡率Fig.2 The mortality of Echinochloa crusgalli at 15 day after treatment with quinclorac at the screening dose

表2 不同稗草樣本對二氯喹啉酸的生物測定結果(整株法)Table 2 The bioassay results of different biotypes of Echinochloa crusgalli to quinclorac using whole plants method(WPM)

此外,由表2可知：稗草對二氯喹啉酸的RF值在死亡率為0～20%區(qū)間(貼牌水培法)內(nèi)隨死亡率降低大幅上升,RF值由340.12升至1 209.38;其次是30%～40%區(qū)間,隨死亡率降低RF值由119.86升至210.09。

2.3 貼牌水培法與整株法所測抗性水平對比

由表3可知,貼牌水培法測定的稗草對二氯喹啉酸的RF值隨著死亡率降低而逐漸遞增,其中所選的7個代表性樣本中50號樣本RF值最高為26.80,而其經(jīng)整株法測出的RF值高達1079.23,后者為前者的40.27倍。此外,其他5個抗性樣本(36、24、14、32、45號)由整株法測定的RF值分別為貼牌水培法的1.51～49.18倍(表2、表3)。以上結果說明,貼牌水培法和整株法測定的同一稗草樣本對二氯喹啉酸的抗性水平趨勢較吻合,但抗性倍數(shù)存在一定差異,可能歸因于二者所用的培養(yǎng)介質(zhì)(水和土壤)、施藥方式(浸藥法和噴霧法)及藥劑吸收途徑(莖葉/根部吸收和莖葉吸收)不同。

表3 不同稗草樣本對二氯喹啉酸的生物測定結果(貼牌水培法)Table 3 The bioassay results of different biotypes of Echinochloa crusgalli to quinclorac using WCMLC

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3 結論與討論

研發(fā)雜草抗藥性的快速鑒定技術是其抗藥性治理的前提。目前,雜草抗藥性的室內(nèi)檢測方法多種多樣,可以基于不同的需求選擇不同的檢測方法[14]。其中,整株法為雜草抗藥性初篩方法中準確可靠和重復性好的常用方法,但因費時費力,難以滿足短時間內(nèi)實現(xiàn)大量樣本對藥劑的抗藥性快速篩選的要求。本研究發(fā)現(xiàn),以營養(yǎng)液為培養(yǎng)介質(zhì)并結合浸藥方式的貼牌水培法,不僅省時省力,而且步驟簡化、易于操作。該方法的難點在于合適的甄別劑量的確定,一方面需了解雜草對某種藥劑的敏感生物型;另一方面需反復試驗、逐步縮小劑量范圍,最終選擇使得至少95%以上的敏感生物型樣本死亡且盡可能小的劑量,作為甄別劑量。此外,由于水培條件下的稗草根系完全浸泡于營養(yǎng)液中,易受有害物質(zhì)積累和病原菌侵染的影響,從而導致個別根系發(fā)生“病變”甚至整株死亡[18]。

從貼牌水培法和整株法測定結果得知,本研究隨機抽取的50份稗草樣本中對二氯喹啉酸存在抗藥性的樣本僅占少數(shù),而高抗的樣本更少。然而,對于稗草抗藥性研究,往往越是高抗的樣本,越有研究價值。因此,針對成千上萬份的大樣本時,建立一種抗藥性快速篩選方法,不僅可以簡化前期的摸索工作,且對于后期的抗藥性機理研究至關重要。本研究系統(tǒng)地比較了貼牌水培法的死亡率與整株法的抗性倍數(shù)之間的關系,結果發(fā)現(xiàn)：稗草死亡率在40%以下時,隨死亡率降低稗草對二氯喹啉酸的抗性倍數(shù)迅猛升高,可能歸因于這些樣本對該藥劑產(chǎn)生了比較高水平的抗藥性。此外,基于ED50的抗性倍數(shù)分析結果表明,貼牌水培法測定的稗草樣本對二氯喹啉酸的抗藥性水平和整株法保持一致,說明該方法結果可靠,適用于稗草抗藥性初篩。

[1] 李揚漢.中國雜草志[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

(責任編輯：楊明麗)

Rapid identification of resistance level of barnyardgrass (Echinochloa crusgalli)to quinclorac using water culture method with label cards(WCMLC)

Li Sifu1,2, Tang Tao2, Liu Xueyuan2, Liu Ducai2, Bai Lianyang3, Ma Guolan2, Peng Yajun2

(1.Institute of Pesticide Science,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Institute of Plant Protection,Changsha 410125,China;3.Hunan Academy of Agricultural Sciences,Changsha 410125,China)

In the present study,50 biotypes of barnyardgrass,Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.,were collected from different rice fields of Hunan Province in 2013,and their resistance levels to quinclorac were conducted using water culture method with label cards(WCMLC)and whole plant method(WPM).The bioassay results showed that the screening dose of quinclorac was 80 mg/L via WCMLC.The lower mortalities of the tested E.crusgalli, the higher values of resistance factor(RF).RF values were 896.07-1 209.38 as for 0 of mortality.Comparing ED50value between WCMLC and WPM,similar resistance level trends of E.crusgalli to quinclorac were observed.The ED50value determined by WCMLC was remarkably lower than that of WPM.There was a higher resistant risk to 80 mg/L of quinclorac when the mortalities of E.crusgalli biotypes was lower than 40%using WCMLC.Therefore,further study was worthy for carrying out in these biotypes.

Echinochloa crusgalli; water culture method with label cards(WCMLC); quinclorac; screening dose; resistance factor

S 451.21

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.027

2014-10-24

2015-01-29

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303031);國家自然科學基金項目(31201530)

*通信作者 E-mail：bailianyang2005@aliyun.com.cn