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    辛伐他汀對耐紫杉醇人肺腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

    2015-07-01 23:44:07蘇克莉郭亮李靜
    山東醫(yī)藥 2015年6期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)辛伐他汀紫杉醇

    蘇克莉,郭亮,李靜

    (1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院,濟(jì)南250013;2濟(jì)南市第四人民醫(yī)院)

    ·臨床研究·

    辛伐他汀對耐紫杉醇人肺腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

    蘇克莉1,2,郭亮2,李靜2

    (1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院,濟(jì)南250013;2濟(jì)南市第四人民醫(yī)院)

    目的 探討辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對人肺腺癌耐紫杉醇細(xì)胞株增殖的影響。方法 用0、10、20、40、80 μmol/L的辛伐他汀處理耐紫杉醇A549細(xì)胞(A549/Taxol)24、36、48 h,用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測算各組細(xì)胞增殖率。用含有20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀組)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇組)及20 μmol/L的辛伐他汀+10-7mol/L紫杉醇(聯(lián)合組)培養(yǎng)A549/Taxol細(xì)胞,24、48 h后用MTT法測算各組細(xì)胞增殖率,24、36、48 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期。結(jié)果 辛伐他汀能濃度依賴性(10 ~40 μmol/L)地抑制耐紫杉醇A549/Taxol細(xì)胞增殖,而且抑制作用呈時(shí)間依賴性(P均<0.05)。相同時(shí)點(diǎn)比較聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率和G1期細(xì)胞比例高于辛伐他汀組、紫杉醇組和空白對照組。結(jié)論 辛伐他汀可抑制A549/Taxol增殖,辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol增殖有協(xié)同抑制作用。

    辛伐他?。蛔仙即?;非小細(xì)胞肺癌;細(xì)胞增殖;細(xì)胞周期

    非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 患者確診時(shí)約2/3已屬晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移,失去手術(shù)機(jī)會(huì),需要化學(xué)藥物治療,但復(fù)發(fā)率高,且對大多數(shù)化療藥物不敏感 ,預(yù)后很差[1]。紫杉醇是NSCLC臨床治療的一線藥物,近年來其耐藥率逐漸升高,嚴(yán)重影響了化療效果[2]。研究發(fā)現(xiàn),他汀類降血脂藥辛伐他汀能顯著抑制乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞增殖,具有較好的抗腫瘤能力[3]。服用他汀類藥物6個(gè)月以上在不同年齡及種族中肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)可下降55%[4]。2013年6月~2013年10月,我們觀察了辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對耐紫杉醇A549細(xì)胞(A549/Taxol)增殖的影響?,F(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人肺腺癌耐紫杉醇A549細(xì)胞株(A549/Taxol)由山東省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng),A549/Taxol細(xì)胞可在10-7mol/L的紫杉醇中正常生長。辛伐他汀、紫杉醇購自中國藥監(jiān)所,溶解稀釋后-20 ℃凍存,使用前用培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度。其他主要儀器和試劑有DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司),四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國Sigma)、二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma)、流式細(xì)胞儀(德國PARTEC公司 )

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549/Taxol細(xì)胞株用含10%胎牛血清及0.1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

    1.2.2 辛伐他汀對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響的觀察 將A549/Taxol細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔平底培養(yǎng)板中,37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),每孔培養(yǎng)液為100 μL。細(xì)胞培養(yǎng)過夜貼壁后,用0、10、 20、 40、 80 μmol/L辛伐他汀分別處理細(xì)胞24、36、48 h,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。培養(yǎng)結(jié)束前每孔加入以磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的5 mg/mL噻唑藍(lán)溶液15 μL,繼續(xù)孵育4 h后,終止培養(yǎng),吸棄孔內(nèi)上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,靜置10 min待結(jié)晶物充分溶解,用酶標(biāo)儀在波長492 nm處測量各孔的吸光值(A)。同時(shí)設(shè)置陰性對照組(僅加DMSO,不加藥物處理) 和空白對照組(無細(xì)胞,僅加無血清DMEM) ,各組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。計(jì)算細(xì)胞抑制率和辛伐他汀的IC50值。取IC50附近的濃度(20 μmol/L)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響的觀察 將A549/Taxol細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔4×103細(xì)胞接種于96孔平底培養(yǎng)板中,37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),每孔培養(yǎng)液體積為100 μL。細(xì)胞培養(yǎng)過夜貼壁后,用含有20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀組)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇組)及含兩藥的培養(yǎng)液(聯(lián)合組)各100 μL培養(yǎng)細(xì)胞24、48 h后用MTT法測吸光度值A(chǔ),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率=[1-(處理組A值-空白組A值)/(陰性組A組-空白組A組)]×100%。

    12.4 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞周期的影響的觀察 將A549/Taxol細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種6孔平底培養(yǎng)板中,細(xì)胞培養(yǎng)過夜貼壁后分別用20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀組)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇組)及20 μmol/L辛伐他汀+10-7mol/L紫杉醇(聯(lián)合組)各100 μL處理細(xì)胞24、36、48 h。收集各組細(xì)胞及正常培養(yǎng)的A549/Taxol細(xì)胞(正常對照組),調(diào)細(xì)胞密度為l×106/mL,PBS漂洗細(xì)胞2次,加入含RNA酶的碘化丙啶(PI)150 μL避光染色30 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,計(jì)算每個(gè)階段細(xì)胞所占的比例。

    2 結(jié)果

    2.1 辛伐他汀對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的辛伐他汀處理后A549/Taxol細(xì)胞增殖抑制率見表1。隨辛伐他汀濃度的升高,增殖抑制率逐漸升高(P均<0.05)。相同濃度辛伐他汀分別處理A549/Taxol細(xì)胞24、36、48 h后,抑制率隨時(shí)間延長逐漸升高(P<0.01)。辛伐他汀對細(xì)胞株有明顯的抑制增殖作用,且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。

    表1 不同濃度辛伐他汀對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響

    2.2 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞增殖抑制率見表2。紫杉醇組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后細(xì)胞增殖更加活躍,證實(shí)A549/Taxol對紫杉醇耐藥。聯(lián)合組培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞增殖抑制率明顯高于紫杉醇組和辛伐他汀組(P均<0.05)。

    表2 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響

    2.3 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、36、48 h后細(xì)胞周期分布見表3。由表3可見,辛伐他汀組各時(shí)點(diǎn)G1期細(xì)胞比例較空白對照組升高、S期細(xì)胞比例較空白對照組降低(P均<0.05),且隨培養(yǎng)時(shí)間延長G1期細(xì)胞比例逐漸升高、S期細(xì)胞比例逐漸降低(P均<0.05)。紫杉醇組各時(shí)點(diǎn)G1細(xì)胞比例與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,S期細(xì)胞比例高于空白對照組(P均<0.05)。聯(lián)合組各時(shí)點(diǎn)G1期細(xì)胞比例較辛伐他汀組、紫杉醇組、空白對照組均升高、S期細(xì)胞比例較辛伐他汀組、紫杉醇組、空白對照組均下降(P均<0.05)。

    表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、36、48 h后細(xì)胞周期分布比較

    3 討論

    紫杉醇是NSCLC臨床治療的一線用藥。紫杉醇作用靶點(diǎn)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的微管,主要通過促進(jìn)蛋白質(zhì)組裝成微管及阻止其解聚,將腫瘤細(xì)胞阻遏在G2期和M期,抑制有絲分裂,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。辛伐他汀結(jié)構(gòu)中具有羥甲基戊二酸的活性結(jié)構(gòu),其作用靶點(diǎn)是羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶,是HMG-CoA還原酶抑制劑。HMG-CoA還原酶是膽固醇生物合成的主要限速酶,通過催化HMG-CoA合成甲羥戊酸(MVA)。Martinez等[5]證實(shí)洛伐他汀通過降低膽固醇合成抑制MVA途徑,誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞停滯于G1期而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此效應(yīng)可因MVA和低密度脂蛋白(LDL)的加入而恢復(fù)細(xì)胞G1→S期的轉(zhuǎn)換。

    本研究結(jié)果顯示,辛伐他汀具有抑制A549/Taxol腫瘤細(xì)胞增殖的作用,且呈濃度、時(shí)間依賴效應(yīng)。10-7mol/L紫杉醇A549/Taxol腫瘤細(xì)胞增殖無明顯影響。 20 μmol/L辛伐他汀聯(lián)合10-7mol/L紫杉醇組對A549/Taxol細(xì)胞增殖的抑制作用,較紫杉醇、辛伐他汀單藥抑制作用明顯。辛伐他汀可以阻滯耐紫杉醇A549細(xì)胞于G1期并且隨培養(yǎng)時(shí)間延長G1期細(xì)胞比例增加,提示辛伐他汀能夠克服紫杉醇耐藥。

    Maksimova等[6]研究表明,他汀類藥物阻滯細(xì)胞于G1/S期的抗增殖作用,可能是通過提高細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑如p21及p27水平發(fā)揮作用的。Cemeus等[7]研究發(fā)他汀類藥物和吉非替尼兩藥聯(lián)用能夠克服NSCLC吉非替尼耐藥,其機(jī)制可能是減少甲羥戊酸產(chǎn)物,抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Park等[8]發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可增加伊立替康對NSCLC細(xì)胞A549和H460的細(xì)胞毒作用,通過提高細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21水平使細(xì)胞周期阻滯于G1期。辛伐他汀與培美曲塞聯(lián)用,可以進(jìn)一步激活惡性間皮瘤細(xì)胞和肺癌細(xì)胞Caspase-3、8、9的表達(dá),增強(qiáng)Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,還可以通過提高促凋亡基因Bim、Puma,降低抑制凋亡基因Mcl-1、Bcl-xL的表達(dá)發(fā)揮促凋亡作用。兩者聯(lián)用還可以協(xié)同導(dǎo)致線粒體功能障礙[9]。本研究結(jié)果顯示,辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇能克服人肺腺癌紫杉醇耐藥,但其具體作用機(jī)制及信號(hào)途徑仍需進(jìn)一步探討。我們將進(jìn)一步研究達(dá)到相同的腫瘤抑制作用時(shí)辛伐他汀能否降低紫杉醇的用量,以降低治療不良反應(yīng),提高治療有效率。

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    濟(jì)南市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目( 2013022)。

    10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.012

    R734.2

    B

    1002-266X(2015)06-0034-03

    2014-12-17)

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