綿羊肺炎支原體的分離鑒定及其HSP70基因遺傳多樣性

胡政香，喬 軍，孟慶玲＊，張金生，陳創(chuàng)夫

（1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子832003；2.新疆沙灣縣獸醫(yī)站，新疆 沙灣832100）

綿羊支原體肺炎（Contagiousovinepleuropneumonia）又稱綿羊傳染性胸膜肺炎，是由綿羊肺炎支原體（Mycoplasmaovipneumoniae，MO）引起的一種高度接觸性傳染病，是以咳嗽、氣喘、發(fā)燒、漸進性消瘦及肺的間質(zhì)增生性炎癥為特征的呼吸道疾病，主要危害1～3月齡的羔羊，呈急性或慢性經(jīng)過，病死率一般為30%～50%，有時高達80%～100%[1－6]。綿羊肺炎支原體自1963年首次分離報道后，相繼在多個國家分離到該病原。我國于1979年在四川阿壩首次發(fā)現(xiàn)該病，由新西蘭和澳大利亞進口的邊區(qū)萊斯特種羊帶入，此后在多個省區(qū)分離到MO[7－12]。近年來，MO 導致羊患傳染性胸膜肺炎病例日趨增多，給養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟損失，但MO的研究卻相對滯后，特別是對于其重要功能蛋白如重要抗原及毒力因子等的研究甚少。

熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）是一種結構上高度保守的多肽，能夠通過易化變性蛋白的修復，幫助新合成多肽鍵的生理折疊與伸展，以及糾正多肽鏈的錯誤折疊等途徑使細胞的功能和結構得到恢復，具有“分子伴侶”的功能[13]。 王楓等[14]通過構建果蠅HSP70缺失突變體發(fā)現(xiàn)，HSP70 對熱應激是必需的。Gomez F J等[15]從有莢膜的組織胞漿菌的細胞壁和細胞膜上分離得到HSP70同源性的抗原物質(zhì)，這種物質(zhì)能誘導小鼠的細胞和體液免疫反應，并能引起有效的免疫保護作用。許鍵等[16]采用隨機擴增多態(tài)性及限制性片段長度多態(tài)性方法，對26 株MO 國內(nèi)分離株進行多態(tài)性研究表明，我國MO 存在高度的基因多態(tài)性，這種多態(tài)性與地域差異相關，與宿主來源也具有一定的相關性。為綿羊支原體肺炎的科學防控提供理論依據(jù)，從新疆塔城地區(qū)7個羊場疑似MO感染綿羊的病變肺組織進行病原分離，通過形態(tài)學、生化試驗及分子生物學等試驗對分離株進行鑒定，并對HSP70基因遺傳多樣性進行檢測。

1 材料與方法

1.1 病料

從新疆塔城地區(qū)塔城市（T）、額敏縣（E）、裕民縣（Y）、托里縣（L）、烏蘇市（W）、沙灣縣（S）和布克賽爾蒙古自治縣（H）7個羊場采集疑似綿羊肺炎支原體感染病死羊肺臟，按1∶10加入生理鹽水中，研碎，3 000r／min離心10min，以0.22μm 濾器過濾。

1.2 主要試劑

KM2液體培養(yǎng)基，購自江蘇農(nóng)業(yè)科學院，在KM2培養(yǎng)基中加入1%低熔點瓊脂糖液，制備4%的固體培養(yǎng)基。葡萄糖、水解精、尿素、美蘭牛乳等細菌微量生化反應管，購自杭州天和微生物試劑有限公司。DNA Marker DL2000、pMD19－T 載體、蛋白Marker等，購自TaKaRa公司。

1.3 病原分離及鑒定

1.3.1 分離 取0.4mL 濾液接種于4mL KM2液體培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3～6 d，當培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時，取液體培養(yǎng)物接種于KM2固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)7d，在低倍顯微鏡下挑取單個菌落接種于液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)物顏色明顯變化后再次接種固體培養(yǎng)基，重復3次。

1.3.2 形態(tài)學鑒定 取純化的培養(yǎng)物接種于KM2固體培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、濕度80%條件下培養(yǎng)，5～7d 后革蘭氏染色，在倒置顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。對菌落進行Dienes染色，利用倒置顯微鏡觀察菌落中心顏色是否為藍色。

1.3.3 生化特性鑒定 分別在葡萄糖、精氨酸、尿素微量生化反應管中接種分離株，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5d，觀察顏色變化。在菌株單個菌落生長良好的平板上加入0.5%豚鼠紅細胞2mL，置于37℃培養(yǎng)20 min 后傾去紅細胞懸液，用PBS 10mL沖洗5次，在低倍鏡下觀察紅細胞吸附于菌落上的情況。用含10%綿羊脫纖血的固體培養(yǎng)基接種各鑒定株，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3～5 d，在顯微鏡下觀察是否有溶血現(xiàn)象。

1.3.4 分子生物學鑒定 用病毒提取試劑盒提取DNA 全基因組DNA。利用MO 特異性引物16S rRNA（P1：5′－GACTTCATCCTGCACTCTGT－3′，P2：5′－TGAACGGAATATGTTAGCTT－3′）對 分離物進行PCR 鑒定。反應體系：預混酶12.5μL，水5.5μL，引物各1μL，模板5μL。反應條件：95℃180s；95℃30s，55℃40s，72℃50s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。將PCR 擴增產(chǎn)物克隆入pMD19－T 載體中，送華大有限公司測序，用DNAMAN 軟件對15 株分離株的16SrRNA 序列同源性進行分析。

1.4 HSP70基因的擴增、克隆及其遺傳多樣性分析

根據(jù)MOHSP70 基因序列，設計特異性引物對5株分離株的HSP70 基因全長進行擴增，克隆入pMD19－T載體中測序，利用生物在線分析軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／，http：／／www.expasy.org／tools／）分 析HSP70 序 列的二級及三級結構、糖基化位點和磷酸化位點，用DNAMAN 軟件進行遺傳多樣性分析，用MEGA 5.0軟件構建HSP70基因系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 病原的特征特性

2.1.1 形態(tài)學特征 純化培養(yǎng)物用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4d后可觀察到針尖狀大小的菌落，菌落呈圓形、無臍、邊緣整齊、乳頭狀（具有1個致密突出的中心點）。培養(yǎng)物切片在油鏡下觀察，菌體被染成紅色，呈多種形態(tài)（圖1）。菌落經(jīng)Dienes染液染色，其中心被染成深藍色、邊緣染色淺，而其他細菌不著色，20min內(nèi)不褪色（圖2）。

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)及菌體染色形態(tài)Fig.1 Colonial morphology and thallus staining of isolated strains

圖2 分離菌株菌落的Dienes染色形態(tài)（80×）Fig.2 Dienes staining of isolated strains（80×）

表 15株分離菌株的生化鑒定結果Table Biochemical identification of 15isolated strains

2.1.2 生化特性 從表中看出，15株分離菌株的生化特性表現(xiàn)相同，能發(fā)酵葡萄糖、不水解精氨酸與尿素、美藍牛乳褪色、吸附紅細胞并導致溶血。

2.1.3 分子生物學特性 從15株分離株基因組總DNA 中擴增出361bp的16SrRNA 片段，與預期片段大小相符（圖3）。與MO 標準毒株Y98（U44771）株16SrRNA 相比，T1、S2、E2、W2分離株的核苷酸同源性為100%，S3分離株為97.81%，T2、Y1、E1、L1、L2、W1、S1、T3、S4、H1分離株分別為96.08%、96.12%、95.8%、94.47%、94.92%、97.07%、98.52%、98.27%、98.69%和97.17%。

圖3 15株分離菌株的PCR 擴增電泳圖譜Fig.3 PCR amplification electrophoretogram of 15isolated strains

2.2 HSP70基因的克隆及序列

經(jīng)測 序，分 離 株L1、W2、H1、T1 和E2 的HSP70基因大小均為747bp，編碼248個氨基酸。編碼的HSP70蛋白二級結構以α－螺旋、延伸鏈和無規(guī)卷曲為主；三級結構呈1個完整的Y 字形三維立體結構；含有2 個潛在的N 末端糖基化位點（Asn14，Asn78）；12 個磷酸化位點（Ser16，Ser21，Ser25，Ser28，Ser44，Ser51，Ser54，Ser80，Ser203，Ser211，Tys169，Tys208）。5 株分離株的HSP70基因核苷酸同源性為94.1%，氨基酸同源性為93.2%，與MO 標準毒株Y98 相比，L1、W2、H1、T1、E2有54 個、43個、53個、43個和53個核苷酸變異位點并在第593位點均插入Gln（谷氨酰胺），說明分離株發(fā)生了遺傳變異。基于HSP70基因的系統(tǒng)進化樹（圖4）表明，5 株MO 分離株均聚在同一支上，且與豬肺炎支原體（M ovipneumoniae SC01）的同源性較高，而與MO 標準毒株Y98不在同一支。

圖4 基于NJ法構建的HSP70基因系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic analysis of HSP70gene based on NJ method

3 結論

通過KM2培養(yǎng)基，從新疆塔城地區(qū)疑似綿羊肺炎支原體感染病死羊肺臟中分離到15株綿羊肺炎支原體疑似分離株，分離株呈典型的乳頭狀菌落，可使葡萄糖酵解產(chǎn)酸、不水解精氨酸和尿素、使美蘭牛乳褪色、具有溶血及吸附紅細胞的特點。通過對分離株16SrRNA 基因序列PCR 擴增和測序，證明15株分離株均為綿羊肺炎支原體。

在成功克隆5 株綿羊肺炎支原體新疆分離株HSP70基因的基礎上，對其基因序列和遺傳多樣性分析，核苷酸的同源性為94.1%，氨基酸同源性為93.2%；與綿羊肺炎支原體標準毒株Y98相比，5株新疆分離株在593位點均插入Gln（谷氨酰胺），表明，不同地域綿羊肺炎支原體流行株HSP70具有較明顯的遺傳多樣性，這可能與綿羊肺炎支原體適應環(huán)境相關。

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