香豬肺源性枯草芽孢桿菌的分離鑒定及體外抑菌作用

陳 江，冉雪琴，王嘉福＊

（1.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽550025；2.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025；3.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025）

芽孢桿菌（Bacillussubtilis）對動(dòng)物和人的病原菌有顯著拮抗作用，因而引起人們的關(guān)注[1]。在體外，枯草芽孢桿菌能夠顯著抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88、鼠傷寒沙門氏菌SL1334的粘附，并抑制鼠傷寒沙門氏菌的內(nèi)化作用[2]。在體內(nèi)，枯草芽孢桿菌與病原菌競爭宿主細(xì)胞的粘附位點(diǎn)，抑制病原菌對宿主細(xì)胞的侵染；同時(shí)，促進(jìn)乳酸桿菌等有益厭氧菌的生長[3]。枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類化合物和氨基酸類等抑菌物質(zhì)，達(dá)到抑制病原菌的作用[4]。豬的常見病原菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌等，主要引起仔豬腹瀉和水腫病、化膿性感染、豬鏈球菌病等。從江香豬等地方豬品種對這類疾病具有較強(qiáng)的抗性[5]，但其抗病機(jī)理不明。為此，筆者以從江香豬為試驗(yàn)材料，從肺部分離到1株枯草芽孢桿菌Bp－1，并對其抑制病原菌的活性進(jìn)行研究，以期為從江香豬等地方豬抗病機(jī)理的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株樣本

產(chǎn)志賀樣毒素Stx2e大腸桿菌P22，為貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從貴州本地仔豬水腫病糞樣中分離[6]。金黃色葡萄球菌S1（Staphylococcus aureus），為貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物研究室贈送[7]。豬 鏈 球 菌 （Streptococcussuisserotype 2，SS2）CVCC607，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，為Ⅱ型豬鏈球菌致病株。

1.2 菌株分離

選取豬肺組織，以適量PBS緩沖液對豬肺進(jìn)行灌洗，按梯度稀釋法稀釋菌懸液[8]，涂布于LB 平板上，37℃、200r／min振蕩培養(yǎng)18h，挑取單菌落加入液體LB培養(yǎng)基中增菌，固體LB平板上劃線分離單菌落。

1.3 生理生化鑒定

取少量菌落制片，經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]進(jìn)行，細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.4 16SrDNA序列測定及二級結(jié)構(gòu)分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[10]抽提分離細(xì)菌的基因組DNA。原核生物16SrDNA 通用引物序列：27f，5′－GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′，1541r，5′－AAGGAGGTGAT CCAGCCGCA－3′，以細(xì)菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用50μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5 min；94℃30s，52℃30s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。PCR 產(chǎn)物純化和測序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。將獲得序列與NCBI GenBank庫中的已知序列進(jìn)行比對，用Mega v6.0軟件Neighbor－joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Bootstrap法1 000 次檢驗(yàn)可信度。通過mfold在線平臺分析16SrRNA 序列的二級結(jié)構(gòu)。

1.5 體外抑菌試驗(yàn)

分離細(xì)菌培養(yǎng)24h，8 000r／min 離心10min，取上清液，將濾紙片（直徑0.8cm）浸泡于上清液中15min。分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌菌液100μL，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，放上浸濕的濾紙片，靜置3min，37℃培養(yǎng)2 ～48h，觀察抑菌情況[11]。用游標(biāo)卡尺測抑菌圈的直徑（diameter of antibiotic circle），以抑菌圈的直徑表示抑菌活性。

1.6 對致病菌的拮抗試驗(yàn)

將分離細(xì)菌分別與大腸桿菌P22、金黃色葡萄球菌S1 和豬鏈球菌CVCC607 按2∶1 接種于50mL LB 液 體 培 養(yǎng) 基 中[12]，以 P22、S1 和CVCC607單獨(dú)培養(yǎng)為對照，37℃、170r／min 振蕩培養(yǎng)，分別于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、24h和48h取樣革蘭氏染色，用平板菌落計(jì)數(shù)法測定每種細(xì)菌的數(shù)量（cfu／mL），重復(fù)計(jì)數(shù)5 次取平均值，計(jì)算致病菌與分離菌的數(shù)量之比[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離和鑒定

采用灌洗法從香豬肺組織液篩選到1 株細(xì)菌Bp－1，菌體呈短桿狀，染色均勻，具運(yùn)動(dòng)性，兼性厭氧，存在內(nèi)生芽孢，芽孢囊膨大呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色陽性（圖1）；在LB 培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則。生化反應(yīng)結(jié)果顯示，菌株Bp－1可利用L－阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、乳糖、甘露醇產(chǎn)酸，還原動(dòng)力－硝酸鹽；接觸酶、氧化酶陽性；能利用果膠、檸檬酸鹽，不能利用丙二酸鹽，可水解馬尿酸鹽、淀粉、酪氨酸，能使明膠液化。

圖1 菌株Bp－1革蘭氏染色Fig.1 Gram staining of strain Bp－1

2.2 16SrDNA基因序列與同源性

以Bp－1基因組DNA 為模板，利用引物27F／1541R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到單一條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化測序，大小為1 429bp，NCBI收錄號為KP229430。

圖2 Bp－1菌株16SrRNA基因片段的擴(kuò)增Fig.2 Amplification of 16SrRNA gene segment of strain Bp－1

經(jīng)比對，Bp－1 基因序列與枯草芽孢桿菌16S rRNA 基因序列的同源性最高，為99%～100%。以16SrDNA 序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），菌株Bp－1 與Bacillussubtilis（KF318713）等的相似性為100%，位于同一分支。

圖3 以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的Bp－1菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Bp－1based on 16S rDNA sequence

2.3 16SrRNA的二級結(jié)構(gòu)

依據(jù)Bacillussubtilisstrain168菌株（ATCC 21331）序列，運(yùn)用mflod 在線平臺分析16SrRNA的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，16SrRNA 有9個(gè)可變區(qū)，即V169－99、V2137－242、V3433－497、V4576－682、V5822－879、V6986－1043、V71117－1173、V81243－1294和V91435－1465[14]。Bp－1 與B.subtilis168間共有6個(gè)堿基不同，只有1個(gè)堿基（A235G）處于V2區(qū)中（表），其他5個(gè)差異堿基落在可變區(qū)外。

表 菌株Bp－1 和B.subtilis strain 168的16SrDNA差異位點(diǎn)Table Different 16SrDNA loci of strain Bp－1and B.subtilis strain 168

圖4 菌株Bp－1和B.subtilis 168的16SrRNA和V2區(qū)二級結(jié)構(gòu)比較Fig.4 The secondary structure of strain Bp－1，B.subtilis 168and V2region

Bp－1和B.subtilis168的16SrRNA 二級結(jié)構(gòu)均由6個(gè)莖、2個(gè)發(fā)卡環(huán)、4個(gè)內(nèi)環(huán)和1個(gè)突變環(huán)組成。在V2區(qū)內(nèi)Bp－1與B.subtilis168只有235位的1個(gè)堿基不同，B.subtilis168為G，Bp－1為A；該堿基處于環(huán)中，沒有改變16SrRNA 分子的二級結(jié)構(gòu)（圖4）。綜合菌株Bp－1的生理生化特征、16SrDNA 核苷酸序列和16SrRNA 二級結(jié)構(gòu)分析，將Bp－1 鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。

2.4 Bp－1對3種致病菌的抑制作用與拮抗作用

枯草芽孢桿菌Bp－1對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的抑制作用均在培養(yǎng)4h 時(shí)達(dá)最高值，之后緩慢下降。4 ～12h抑菌效果：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞豬鏈球菌；14 ～18h抑菌效果：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞豬鏈球菌；24h后只對大腸桿菌有抑制作用（圖5）。

圖5 枯草芽孢桿菌Bp－1對致病菌的抑制和拮抗作用Fig.5 Effect of strain Bp－1on inhibition and antagonism of pathogenic bacteria

枯草芽孢桿菌Bp－1對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌均呈現(xiàn)一定的拮抗作用，總體上枯草芽孢桿菌Bp－1對大腸桿菌的拮抗作用最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌的拮抗作用較弱（圖5）。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)在從江香豬肺組織液中分離到1 株細(xì)菌Bp－1，菌株的16SrDNA 核苷酸序列與B.subtilis168的相似性為99%，有6個(gè)堿基不同，其中只有1個(gè)堿基A235G 位于可變區(qū)V2中，此堿基處于環(huán)中，沒有引起16SrRNA 二級結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化檢測將其鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。

枯草芽孢桿菌Bp－1對產(chǎn)志賀樣毒素Stx2e大腸桿菌P22、金黃色葡萄球菌S1和豬鏈球菌3種致病菌均有一定的抑制作用。在固體培養(yǎng)基上，菌株Bp－1上清液對3種致病菌的抑制作用均在4h時(shí)達(dá)最高值，之后緩慢減弱，對金黃色葡萄球菌S1和大腸桿菌P22的抑制作用較強(qiáng)，對豬鏈球菌CVCC607的抑制作用最弱，表明菌株Bp－1的培養(yǎng)液中含有抑菌物質(zhì)。當(dāng)枯草芽孢桿菌Bp－1與病原菌在相同的液體環(huán)境中生長時(shí)，Bp－1對3種病原菌的拮抗作用發(fā)生了變化，總體上對大腸桿菌P22的抑制作用較強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌S1的抑制作用較弱。微生態(tài)學(xué)生物頡頏理論認(rèn)為，枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生生物酶、乳酸、丙酸、過氧化氫和細(xì)菌素等物質(zhì)，同時(shí)枯草芽孢桿菌與病原菌競爭營養(yǎng)和氧氣，抑制病原菌的生長[15]。病原菌可以將枯草芽孢桿菌分泌的抗菌物質(zhì)進(jìn)行分解或利用，導(dǎo)致液體環(huán)境中的抗菌物質(zhì)減少[13，16]，也會 導(dǎo) 致Bp－1 的 抑 菌 作 用 減 弱。 試 驗(yàn) 結(jié)果表明，3種病原菌對枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的敏感性有差異。已有研究證明，枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生芬枯草菌素（fengycinA、B）、抗菌肽、伊枯草菌素（iturin）等物質(zhì)[17]，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌對這些抗菌肽的敏感性明顯不同[18]。

香豬肺源性枯草芽孢桿菌Bp－1對致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌均有抑制作用，Bp－1可作為益生菌對其進(jìn)行深入研究。

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