利用抑制消減雜交技術(shù)分離醬香風(fēng)味的相關(guān)基因

朱德麗，謝 和，李茂琴

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025）

從醬香型白酒提出至今，醬香酒的主體香成分及其產(chǎn)生機制一直是白酒研究的熱點。最初關(guān)于醬香酒風(fēng)味物質(zhì)的形成與微生物關(guān)系的研究一般集中在對工藝改進或用純種微生物強化發(fā)酵，對醬香酒的釀造微生物研究主要集中在某些影響醬香酒酒體質(zhì)量的微生物分離、篩選及鑒定上[1－3]。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物技術(shù)已逐步應(yīng)用于釀酒微生物的研究[3－9]，通過分析微生物的DNA 序列，從基因水平上對與醬香形成相關(guān)的微生物進行定性和定量研究，能更全面、深入地了解和揭示醬香風(fēng)味物質(zhì)的形成機理。莊名揚等[10]自醬香型大曲中分離、篩選到地衣芽孢桿菌（B3－1）等多株芽孢桿菌，其中只有B3－1菌株能產(chǎn)生2，3－丁二醇，并形成醬香，將其判定為醬香功能細(xì)菌。其能通過單獨發(fā)酵產(chǎn)生醬香風(fēng)味，這可能與這類菌株在長期進化過程中形成一些特異性基因有關(guān)，如耐高溫、獨特香味代謝特性等。鑒于醬香形成機理較復(fù)雜，目前極少有白酒醬香相關(guān)基因的報道[11－12]。獲取和鑒定相關(guān)基因，是醬香酒研究領(lǐng)域的難點。由于醬香酒香氣成分復(fù)雜，在短期內(nèi)也難以弄清釀造過程中復(fù)雜的微生物區(qū)系以及高溫條件下微生物對醬香酒的具體貢獻。筆者擬從單一的產(chǎn)醬香功能菌作為切入點，依據(jù)差異基因分離策略，應(yīng)用抑制消減雜交（SSH）技術(shù)篩選與產(chǎn)醬香相關(guān)的基因序列，進一步運用數(shù)據(jù)庫分析基因代謝產(chǎn)物與醬香形成的相關(guān)性，為今后深入研究白酒醬香風(fēng)味形成機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 產(chǎn)醬香枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）E20菌株，不產(chǎn)醬香枯草芽孢桿菌10075菌株均由貴州大學(xué)微生物學(xué)實驗室提供。

1.1.2 試劑 DNA marker DL2000、DNA marker DL10000、Ex Taq DNA 聚合酶、pMD 18－T Vector、Clontech PCR－SelectTM Bacterial Genome Subtraction Kit（Cat No.637404，Clontech）等購于大連TaKaRa公司，Bacterial gDNA Miniprep Kit（陽性細(xì)菌基因組提取試劑盒）購于Biomiga 公司，4S green核酸染料、SanPrep柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 儀器 PCR 儀（MyCycler）、凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR＋）購自美國Bio－Rad公司，穩(wěn)壓電泳儀（DYY-4）購自北京六一儀器廠，壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-280MD）購自嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 枯草芽孢桿菌基因組DNA的提取

按陽性細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取枯草芽孢桿菌的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量。

1.3 抑制消減雜交

以產(chǎn)醬香E20菌株的基因組DNA 作為消減雜交的試驗方，以不產(chǎn)醬香10075菌株的基因組DNA作為消減雜交的驅(qū)動方，依照Clontech 公司的PCR－Select Bacterial Genome Subtraction Kit說明書，驅(qū)動方DNA 和試驗方DNA 樣品分別用RsaI完全酶切后，用1%的瓊脂糖電泳進行酶切效率的檢測，確定完成酶切后，加入2.5μL 0.2 mol／L EDTA（pH 8.0）終止反應(yīng)。用苯酚∶三氯甲烷∶異戊醇（體積比為25∶24∶1）抽提并用乙醇沉淀收集DNA。將酶切后回收的雙鏈DNA（Tester）分成2份分別連接接頭1R 及接頭2R，以23SRNA 正向引物和PCR Primer1、23SRNA 正向和反向引物分別進行PCR 擴增，檢測接頭連接效率，若這2 種PCR 產(chǎn)物的條帶亮度相差不超過4倍，說明接頭連接成功，否則需要重復(fù)連接反應(yīng)。

確保接頭連接成功后，將過量的驅(qū)動方DNA分別加入連有接頭1R 和2R 的試驗方DNA 反應(yīng)管中，98℃反應(yīng)1.5min，然后63℃退火1.5h，完成第1輪雜交反應(yīng)。將第1次的2個雜交試驗方樣品混合，加入過量新鮮的變性驅(qū)動方DNA，63℃雜交過夜，完成第2輪消減雜交。以2輪雜交完成后的雜交產(chǎn)物為模版，Primer1為引物進行第1次PCR 擴增，將第1次PCR 擴增產(chǎn)物稀釋10倍后取1μL作為第2輪PCR 的模板，以1對巢式引物進行擴增，完成2次PCR。分別以濃度大致相同的已消減、未消減的2 次PCR 產(chǎn)物為模版，選擇L516S、L523R引物擴增16～23S 間隔區(qū)作為引物進行PCR 擴增，依次在18個、23個、28個和33個循環(huán)后取出5 μL產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若消減和未消減的條帶出現(xiàn)相差5個循環(huán)及以上，說明消減效率較高。

1.4 基因組DNA消減文庫的構(gòu)建及重組子的鑒定

采用上海生工PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化第2次PCR 產(chǎn)物，并取適量與pMD18－T 載體連接，將連接反應(yīng)物加到100μL的感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于X－gal／IPTG Amp瓊脂培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)。隨機挑取白色克隆，接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，隨機篩選32個在含氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中生長的克隆，用primer1R（NP1R），primer 2R（NP2R）引物進行PCR 反應(yīng)，檢測插入的片段，判斷陽性重組率。根據(jù)克隆插入片斷大小，并篩選大于100bp片段。

1.5 差異基因的測序及序列分析

在轉(zhuǎn)化平板中挑選白色克隆共77個，用含氨芐的LB培養(yǎng)16h 后，篩選陽性克隆委托invitrogen公司測序，得到的序列去掉兩端的載體序列，從NCBI（the National Center for Biotechnology and Information，NCBI）獲取枯草芽孢桿菌的完整基因組的基因注釋信息，構(gòu)建blast數(shù)據(jù)庫，使用文庫測序基因片段對菌株數(shù)據(jù)庫進行同源檢索，對每個序列分別進行注釋。然后進行GO 富集分析（包含生物過程、細(xì)胞組成、分子功能3個部分）、相關(guān)酶分析及KEGG 代謝途徑分析。最后，將文庫測序基因中的酶與乙偶姻、乙酰乳酸合成酶（alsS）基因、乙酰乳酸脫羧酶（alsD）基因及其相關(guān)代謝進行網(wǎng)絡(luò)互作分析，并將其與美拉德反應(yīng)相關(guān)的反應(yīng)物進行網(wǎng)絡(luò)互作分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌基因組

由圖1顯示，提取枯草芽孢桿菌10075菌株及E20菌株基因組DNA 較完整，無顯著降解，可用于下一步試驗。

圖1 枯草芽孢桿菌E20、10075基因組Fig.1 E20and 10075genome of B.subtilis

2.2 消減雜交分離差異DNA片段

2.2.1 基因組DNA 的酶切 高質(zhì)量的試驗方DNA 和驅(qū)動方DNA 分別用RsaI酶切，電泳后條帶呈彌散狀，主要為200～2 000bp。確定完成酶切后調(diào)整DNA 的濃度約為300ng／mL。

圖2 基因組DNA 接頭連接效率瓊脂糖電泳圖譜Fig.2 Agarose electrophoresis of connection efficiency of genome DNA joints

2.2.2 接頭連接效率分析 由圖2顯示，Testeri－1／2接頭序列用引物P1／23SRNA均能在有效循環(huán)數(shù)內(nèi)擴展出條帶，相比較用23SRNA Primer 和PCR Primer1擴展的條帶較亮，相差不大，說明接頭連接良好。

2.2.3 差減后產(chǎn)物的2輪PCR 擴增 由圖3可見，第2次PCR 產(chǎn)物條帶呈彌散帶，分布比第1次PCR 產(chǎn)物集中，說明2菌株同源DNA 序列已被成功扣除，試驗方DNA 的特異性片段得到有效富集。說明，2輪消減雜交成功。

圖3 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜Fig.3 Agarose electrophoresis of PCR products

圖4 L516S和L523R 引物擴增的消減效率圖譜Fig.4 Amplification subtraction efficiency of L516Sand L523Rprimers

2.2.4 消減雜交效率 由圖4可見，消減的在23個循環(huán)時出現(xiàn)條帶，但未消減的在18個循環(huán)時已經(jīng)出現(xiàn)條帶，說明消減效率較高。

2.3 消減產(chǎn)物的克隆及序列的同源性

2次PCR 產(chǎn)物純化后經(jīng)pMD18－T Vector轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）功能細(xì)胞DH5α的陽性克隆，涂布在平板上生長14～16h后，藍色不明顯，將其于4℃放置24h后，藍色明顯加深。PCR 鑒定陽性克隆結(jié)果顯示（圖5），其中隨機挑選的32個克隆中，陽性克隆為29個，陽性重組率大于90%，滿足隨機挑選克隆測序要求，從而成功建立產(chǎn)醬香的特異性基因組DNA 消減文庫。

圖5 插入片段陽性克隆大小的檢測Fig.5 Positive clone size of the insertion fragment

2.4 差異基因文庫的生物信息學(xué)分析

測序后初步獲得的77個差異基因序列，其中有65條獲取準(zhǔn)確注釋，平均相似度98%，E－value ＜1E－07。文庫測序基因包括肽鏈釋放因子2（prfB）、苯丙氨酰tRNA 合成酶的β鏈（pheT）、谷氨酰胺合成酶（glnA）、DNA 旋轉(zhuǎn)酶A 亞單位（gyrA），組氨酸解氨酶（hutH）、HTH 型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子yybE（yybE）、表面活性素合成酶亞基1（srfAA）、表面活性素合成酶亞基2（srfAB）等。65 個基因的GO（gene ontology）富集分析顯示，這些基因主要是各種核苷結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞氨基酸代謝過程和碳水化合物運輸過程。KEGG 代謝通路富集計算顯示，氮代謝（Nitrogen metabolism）最顯著相關(guān)。酶分析顯示，在65個代謝物中有26個酶。

從以數(shù)據(jù)庫為依據(jù)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖6A 可知，DNA 旋轉(zhuǎn)酶A 亞單位（gyrA）和HTH 型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子yybE（yybE）通過調(diào)節(jié)乙偶姻脫氫酶操縱子轉(zhuǎn)錄激活因子（acoR）的活性，從而直接調(diào)節(jié)乙偶姻相關(guān)代謝；同時gyrA還可以通過與pheT相互作用，連同谷氨酰胺合成酶（glnA）一起調(diào)節(jié)乙酰乳酸合成酶（alsS）的代謝；而乙酰乳酸在乙酰乳酸脫羧酶（alsD）作用下生成乙偶姻，2個分子乙偶姻和2個分子氨反應(yīng)，生成四甲基吡嗪，乙偶姻還可以通過下游代謝反應(yīng)生成2，3－丁二醇。

從網(wǎng)絡(luò)圖6B 可知，文庫測序的基因中的苯丙氨酰tRNA 合成酶的β鏈（pheT）、表面活性素合成酶亞基1（srfAA）、肽鏈釋放因子2（gyrA）等與苯丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、酪氨酸等氨基酸也在代謝方面存在一定聯(lián)系。此外，從網(wǎng)絡(luò)圖6B 還發(fā)現(xiàn)，文庫測序基因與兒茶酚等酚類和一些其他小分子也存在聯(lián)系。

圖6 文庫測序基因與其他代謝物和反應(yīng)物的相關(guān)性Fig.6 Correlations between other metabolins，reactant and library sequencing gene

3 結(jié)論與討論

1）gyrA和yybE等基因與乙偶姻、alsD、alsS及其相關(guān)代謝的相關(guān)性。2，3－丁二醇是一種白酒中普遍使用的香味添加劑，而吡嗪類化合物為醬香酒中的特征風(fēng)味物質(zhì)之一。與香味直接相關(guān)的物質(zhì)乙偶姻，亦稱3－羥基－2－丁酮（acetoin），其單體為無色或淡黃色液體，為一種天然的香味化合物，具有愉快的香氣，在國際上被廣泛應(yīng)用，多被作為香味增強劑用在奶油、干酪、咖啡、果實的加工中。據(jù)報道芽孢桿菌能合成大量 的乙偶姻[13]，Nicholson報道[14]其相關(guān)的基因信息為bdhA等。鄭磊[11]對枯草芽孢桿菌E20的alsS基因進行敲除試驗顯示，alsS基因失活后的E20 菌株模擬醬香發(fā)酵黃豆的香味與在失活前相比變化很大，醬香風(fēng)味消失，表明alsS基因及其相關(guān)代謝過程與醬香風(fēng)味的形成有直接聯(lián)系。表明，DNA 旋轉(zhuǎn)酶A 亞單位（gyrA）和HTH型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子yybE（yybE）等文庫測序基因通過調(diào)節(jié)alsS及乙偶姻的相關(guān)代謝，從而間接影響醬香風(fēng)味的形成。

2）gyrA、pheT、prfB等基因與美拉德反應(yīng)的相關(guān)性。法國化學(xué)家梅拉德發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，游離的氨基酸或蛋白質(zhì)與還原糖之間發(fā)生反應(yīng)，最終生成棕褐色的化合物。這類反應(yīng)不僅影響食品的顏色，而且對食品的香味存在重要影響，并將此反應(yīng)稱為非酶棕化反應(yīng)或美拉德反應(yīng)。早在1992年，趙維娜等[15]提出細(xì)菌發(fā)酵過程中有美拉德反應(yīng)發(fā)生。1997年，莊名揚[16]指出，醬香型酒的酒體成分與美拉德反應(yīng)關(guān)系密切，而且美拉德反應(yīng)與水分、酸堿度、溫度、時間等因素有關(guān)。Kam Huey Wong等[17]研究了17種氨基酸與葡萄糖在酸性條件下的美拉德反應(yīng)的產(chǎn)香情況，其中苯丙氨酸和酪氨酸反應(yīng)可以產(chǎn)生干玫瑰香氣，賴氨酸和纈氨酸反應(yīng)產(chǎn)生燒焦糖香氣。邵元龍[18]通過模擬發(fā)酵對枯草產(chǎn)醬香芽孢桿菌E20進行研究，在其發(fā)酵液中檢測到苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸等多種氨基酸，而在不產(chǎn)醬香的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中幾乎未檢測到氨基酸。這些研究充分說明，氨基酸或蛋白質(zhì)對醬香酒的呈香有重要貢獻。

自用美拉德反應(yīng)解釋醬香酒香氣的產(chǎn)生機制以來，褐變及產(chǎn)香一直被作為篩選醬香型功能細(xì)菌的關(guān)鍵指標(biāo)。褐變反應(yīng)包括非酶褐變及酶促褐變2種，非酶褐變在醬香大曲中涉及到美拉德反應(yīng)，而酶促褐變反應(yīng)主要涉及到酚氧化酶類，包括單酚氧化酶，如酪氨酸酶。酪氨酸酶主要的作用底物為酪氨酸。酪氨酸酶參與的褐變反應(yīng)主要包括人頭發(fā)及皮膚黑色素的形成、果蔬的氧化褐變等。多酚氧化酶如兒茶酚酶、漆酶等參與氧化的底物為二元酚和多元酚類化合物，如兒茶酚（鄰苯二酚）、漆酚等。

酶是代謝產(chǎn)物的直接催化劑，文庫差異基因gyrA、pheT、prfB等通過一系列復(fù)雜生化反應(yīng)，催化產(chǎn)生大量是氨基酸和小分子，為美拉德反應(yīng)提供了前提物質(zhì)及反應(yīng)環(huán)境，最終反應(yīng)生成大量的吡嗪類、呋喃類等呈香化合物，形成一種復(fù)雜的復(fù)合香。

本試驗分離出與醬香形成可能相關(guān)的基因序列，其中某些基因片斷間接顯示其在產(chǎn)香味物質(zhì)前體中的潛力，如苯丙氨酰tRNA 合成酶的β鏈（pheT）、DNA 旋轉(zhuǎn)酶A 亞單位（gyrA）和HTH 型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子yybE（yybE）等與之相關(guān)的基因可能是菌株是否產(chǎn)醬香或產(chǎn)醬香強弱的重要原因，雖然這些信息不能作為產(chǎn)醬香菌株的表型差異的直接證據(jù)，但構(gòu)建的產(chǎn)醬香差異基因文庫信息，為進一步研究這些基因片斷在產(chǎn)醬香芽孢桿菌中發(fā)揮的作用提供線索，為今后深入研究醬香的形成機制奠定基礎(chǔ)。

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