日本鵪鶉艾美爾球蟲人工感染試驗及內(nèi)生發(fā)育研究

張 敏， 齊 萌， 李志勇， 王 聰， 王 芳， 馬超鋒， 張龍現(xiàn)， 菅復(fù)春， 寧長申

(1.焦作市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 焦作 454003； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 3.焦作市畜牧工作站，河南 焦作 454003； 4.河南新正好生物工程有限公司，河南 鄭州 450002； 5.信陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽 464000)

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日本鵪鶉艾美爾球蟲人工感染試驗及內(nèi)生發(fā)育研究

張 敏1， 齊 萌2， 李志勇1， 王 聰3， 王 芳4， 馬超鋒5， 張龍現(xiàn)2， 菅復(fù)春2， 寧長申2

(1.焦作市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 焦作 454003； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 3.焦作市畜牧工作站，河南 焦作 454003； 4.河南新正好生物工程有限公司，河南 鄭州 450002； 5.信陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽 464000)

為研究日本鵪鶉艾美爾球蟲(Eimeriauzura)內(nèi)生發(fā)育過程及致病性，人工接種8日齡鵪鶉1.0×105個日本鵪鶉艾美爾球蟲孢子化卵囊。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日本鵪鶉艾美爾球蟲在鵪鶉體內(nèi)潛隱期為5 d，顯露期為13 d，發(fā)病率為70.3%，死亡率為7.5%，增重明顯受到影響.組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，日本鵪鶉艾美爾球蟲主要寄生于鵪鶉十二指腸和空腸前段，內(nèi)生發(fā)育過程經(jīng)三代裂殖生殖階段和一個配子生殖階段，接種后102 h達到裂殖生殖階段高峰期，接種后114 h達到配子生殖階段高峰期，感染后120 h形成卵囊；所有內(nèi)生階段均在腸上皮細胞內(nèi)發(fā)育。日本鵪鶉艾美爾球蟲寄生可引起鵪鶉十二指腸上皮細胞發(fā)生輕度顆粒變性、壞死，黏膜固有層有大量炎性細胞浸潤，充血出血. 試驗結(jié)果表明，日本鵪鶉艾美爾球蟲對鵪鶉有中等致病性。

艾美爾球蟲；內(nèi)生發(fā)育；裂殖生殖；配子生殖

球蟲病是一種對鵪鶉危害嚴重的常見寄生蟲病，給養(yǎng)鶉業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失[1]。已報道的鵪鶉球蟲有16種，但有關(guān)鵪鶉球蟲內(nèi)生發(fā)育和致病性研究報道較少，國外研究者對鵪鶉巴氏艾美爾球蟲(Eimeriabateri)、萊泰艾美爾球蟲(E.lettyae)和原尾艾美爾球蟲(E.procera)的生活史、生物學(xué)特性和致病性進行了研究[2-5]。楊芷云等[6]通過人工感染試驗對角田氏艾美爾球蟲(E.tsunodai)在鵪鶉體內(nèi)發(fā)育過程和致病性進行了觀察。國內(nèi)鵪鶉球蟲感染主要以巴氏艾美爾球蟲和日本鵪鶉艾美爾球蟲(E.uzura)為主[1、7]，RAO等[8]通過動物感染試驗發(fā)現(xiàn)，接種1.0×105個日本鵪鶉艾美爾球蟲卵囊的3日齡日本鵪鶉，死亡率為6.6%。本研究旨在采用單卵囊感染、繼代擴增獲得的日本鵪鶉艾美爾球蟲孢子化卵囊感染8日齡雛鶉，對日本鵪鶉艾美爾球蟲內(nèi)生發(fā)育過程和致病性進行研究，以期為鵪鶉球蟲病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用卵囊

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實驗室經(jīng)雛鶉單卵囊擴增的日本鵪鶉艾美爾球蟲卵囊，孢子化后于2.5%重鉻酸鉀溶液中4 ℃保存，定容至1.0×106個·mL-1，保存時間不超過40 d。

1.2 試驗動物及分組

1日齡朝鮮龍城系鵪鶉公雛150只，購自河南省焦作市武陟縣某鵪鶉孵化場。動物房采用高錳酸鉀和甲醛熏蒸法消毒，籠具經(jīng)火焰噴燈消毒。用飽和食鹽溶液漂浮法連續(xù)檢查7 d，狀態(tài)良好、糞便檢查球蟲卵囊陰性的鵪鶉供試驗用。 8日齡雛鶉隨機分為3組，其中第Ⅰ組60只為病理變化觀察組，第Ⅱ組40只為臨床癥狀觀察組，第Ⅰ組和第Ⅱ組雛鶉每只經(jīng)嗉囊接種1.0×105個孢子化日本鵪鶉艾美爾球蟲卵囊，第Ⅲ組40只為不感染對照組。 各試驗組雛鶉分別隔離飼養(yǎng)，喂全價料，自由飲水。

1.3 臨床觀察

接種后每日觀察并記錄各組雛鶉的精神狀態(tài)，飲食狀況，糞便性狀和發(fā)病、死亡情況等，每日分組收集糞樣，采用飽和食鹽溶液漂浮法進行糞便學(xué)檢查。感染前及試驗結(jié)束時對臨床癥狀觀察組和不感染對照組鵪鶉逐只稱重，計算平均體重和增重。

1.4 病變觀察和取樣

接種卵囊后，每6 h隨機剖殺病理變化觀察組2只雛鶉，觀察其腸、腎、肝和脾等組織器官病變，至糞便檢查發(fā)現(xiàn)卵囊時不再剖殺。取剖殺后雛鶉臟器和腸道組織，包括十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸，各取2段，樣品置10%中性福爾馬林固定液中，常溫保存?zhèn)溆?。采用石蠟包埋切片法進行組織切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(H-E)染色后，置OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

感染組雛鶉接種卵囊后，大部分于感染后(Days Post Infection，DPI) 4 d表現(xiàn)精神沉郁，食欲減退、飲欲增加，出現(xiàn)糞便稀薄，血便，持續(xù)至感染后第8天，期間出現(xiàn)死亡；臨床癥狀觀察組40只雛鶉發(fā)病率為70.3% (29/40)，死亡率為7.5% (3/40)；不感染對照組雛鶉精神狀態(tài)始終良好，糞便性狀正常，未出現(xiàn)死亡情況。 病理變化觀察組和臨床癥狀觀察組雛鶉均于感染后第5天在糞便中查到卵囊，日本鵪鶉艾美爾球蟲潛隱期為5 d，顯露期為13 d，不感染對照組未見卵囊排出。

2.2 雛鶉增重情況

接種卵囊前(DPI 0)，臨床癥狀觀察組和不感染對照組雛鶉平均體重分別為15.4、15.3 g，試驗結(jié)束時(DPI 17)，臨床癥狀觀察組和不感染對照組雛鶉平均體重分別為47.8、59.4 g，增重分別為32.4、44.1 g。

2.3 內(nèi)生發(fā)育觀察

日本鵪鶉艾美爾球蟲內(nèi)生發(fā)育階段蟲體主要寄生于鵪鶉十二指腸和空腸前段，接種后102 h達到裂殖生殖階段高峰期，接種后114 h達到配子生殖階段高峰期，接種后120 h形成卵囊。

2.3.1 裂殖體和裂殖子 日本鵪鶉艾美爾球蟲裂殖體主要寄生于十二指腸絨毛上皮細胞內(nèi)，接種后12 h可見子孢子侵入細胞，形成分界不清晰呈紫色的核。接種后24～48 h第1代裂殖體逐漸成熟，形狀不規(guī)則，平均大小為4.8 μm (2.6～6.6 μm)×3.8 μm(2.6～5.2 μm)，含有3～5個分界清晰的紫色核。接種后42 h可見數(shù)量極少的第1代裂殖子，一個帶蟲空泡中有數(shù)個呈新月形的裂殖子，平均大小為4.5 μm (2.4～6.3 μm)×1.2 μm(0.8～1.5 μm)。接種后60 h產(chǎn)生第2代裂殖體，內(nèi)含5～10個核，形狀不規(guī)則，平均大小為4.5 μm (2.8～6.5 μm)×3.9 μm(2.1～5.2 μm) (圖1-A)。接種后66 h 1個第2代裂殖體產(chǎn)生5～10個第2代裂殖子，平均大小為2.0 μm (1.8～2.4 μm)× 1.0 μm (0.8～1.3 μm)。接種后90 h開始產(chǎn)生第3代裂殖體，接種后96 h裂殖體數(shù)量明顯增多，形狀規(guī)則，多呈長橢圓形或圓形，平均大小為7.0 μm (3.9～12.9 μm)×5.2 μm (3.9～7.7 μm) (圖1-B)。接種后96 h產(chǎn)生呈香蕉形的第3代裂殖子，接種后102 h達到裂殖生殖階段高峰期，裂殖子平均大小為2.8 μm (2.2～3.5 μm)×1.4 μm (1.0～1.0 μm) (圖1-C)。

2.3.2 配子體和配子 接種后108～120 h在十二指腸和空腸前段腸腺上皮細胞及固有膜中可觀察到處于不同發(fā)育時期的配子體。大、小配子體均由裂殖體發(fā)育而來，大配子體細胞逐漸增大，胞漿顏色隨之變淡，同時在細胞質(zhì)中形成界限清晰的嗜酸性顆粒，至大配子體成熟時，嗜酸性顆粒聚集到細胞膜內(nèi)層，大配子體大小為(7.7～18.1) μm×(5.2～12.9) μm，在發(fā)育過程中，細胞中央始終含1個紫色核(圖1-D)。早期小配子體細胞質(zhì)呈紫紅色，隨著發(fā)育，小配子體細胞逐漸增大，出現(xiàn)愈來愈多界限清晰紫色的核，逐漸向細胞膜移動，細胞中央只有少量的核及絮狀殘體，小配子體大小為(2.6～7.7)μm×(2.6～7.2)μm，成熟小配子為長絲狀或新月狀，呈均紫色(圖1-E)。配子生殖階段，可見大量裂殖體和裂殖子同時存在(圖1-F)。

A. 接種后60 h十二指腸上皮細胞內(nèi)第2代裂殖體 (×1 000)； B. 接種后96 h十二指腸上皮細胞內(nèi)成熟的第3代裂殖體 (×1 000)； C. 接種后102 h十二指腸上皮細胞內(nèi)第3代裂殖子 (×1 000)； D. 接種后108 h十二指腸上皮細胞內(nèi)成熟的大配子體 (×1 000)； E. 接種后108 h十二指腸上皮細胞內(nèi)成熟的小配子體 (×1 000)； F. 接種后114 h十二指腸上皮細胞內(nèi)成熟的第3代裂殖體和成熟的大配子體 (×1 000)； G. 接種后114 h十二指腸上皮細胞內(nèi)的卵囊 (×400)； H. 十二指腸黏膜固有層大量炎性細胞浸潤 (×400)； I. 十二指腸局部出血 (×1 000)

A. The second generation meront in the epithelial cells of duodenum at 60 h post-infection (×1 000); B. The third generation meront in the epithelial cells of duodenum at 96 h post-infection (×1 000); C. The third generation merozoite in the epithelial cells of duodenum at 102 h post-infection (×1 000); D. Mature macrogametocyte in the epithelial cells of duodenum at 108 h post-infection (×1 000); E. Mature microgametocyte in the epithelial cells of duodenum at 108 h post-infection (×1 000); F. Mature third generation meront and macrogametocyte in the epithelial cells of duodenum at 114 h post-infection (×1 000); G. Oocysts in the epithelial cells of duodenum at 114 h post-infection (×400); H. A large number of inflammatory cell infiltration in the mucosa lamina propria of duodenum (×400); I. Local hemorrhage in duodenum (×1 000)

圖1 日本鵪鶉艾美爾球蟲內(nèi)生發(fā)育及病理變化

Fig.1 Observation of endogenous development stages and pathological changes ofE.uzura

2.3.3 卵囊 大配子體與小配子結(jié)合后，形成合子，細胞內(nèi)層的顆粒聚合形成囊壁，孢子體充滿整個卵囊，內(nèi)有大量細小淡紫色顆粒和一個細胞核。感染后114～120 h可在腸內(nèi)容物和腸道上皮細胞中觀察到卵囊，感染后120 h可從糞便中檢查到卵囊(圖1-G)。

2.4 病理變化

日本鵪鶉艾美爾球蟲引起的病變主要集中于鵪鶉十二指腸及空腸前段。感染后6～84 h，蟲體處于裂殖生殖階段初期，腸絨毛和腸腺上皮細胞基本保持完整，無明顯肉眼可見病變，期間粘膜涂片上見未完全分化的裂殖體和成熟裂殖體，也可見未成熟的裂殖子和數(shù)量較少的成熟單個裂殖子存在。接種后90～108 h，開始出現(xiàn)較為明顯的病變，十二指腸腸壁增厚，粘膜表面有出血點，粘膜涂片上見大量成熟裂殖體，內(nèi)含較多裂殖子。切片可見十二指腸及空腸前段腸絨毛上皮細胞發(fā)生輕度顆粒變性、壞死，黏膜固有層有大量炎性細胞浸潤，有出血和充血現(xiàn)象(圖1-H，圖1-I)。接種后108～120 h，切片可見大量裂殖體、配子體和合子，亦可見少量卵囊，宿主上皮細胞中寄生多個蟲體，腸絨毛輕度萎縮。其他組織器官未見病變，也未觀察到內(nèi)生發(fā)育階段的蟲體。

3 討論

3.1 日本鵪鶉艾美爾球蟲對雛鶉的致病性

TSUNODA等[9]報道用1.0×105個日本鵪鶉艾美爾球蟲卵囊接種3日齡日本鵪鶉，DPI5～8時出現(xiàn)腹瀉和貧血，本次試驗發(fā)現(xiàn)1.0×105個日本鵪鶉艾美爾球蟲卵囊接種8日齡朝鮮龍城系鵪鶉，DPI4～9時出現(xiàn)糞便稀薄和血便，無明顯貧血癥狀。RAO等[8]試驗發(fā)現(xiàn)3日齡日本鵪鶉接種1.0×105個日本鵪鶉艾美爾球蟲卵囊后觀察至第6周，雛鶉3周內(nèi)死亡率為6.6%，3～6周無死亡，感染組和不感染組雛鶉平均體重增重分別為136.9、144.8 g；RUFF等[3]報道用5.0×105個日本鵪鶉艾美爾球蟲(占65%)和角田氏艾美爾球蟲(占35%)混合卵囊感染3日齡和17日齡日本鵪鶉時，死亡率分別100%和8%，表明隨著鵪鶉年齡增長，球蟲致死率顯著降低。本次試驗發(fā)現(xiàn)DPI4～9雛鶉死亡率為7.5%，試驗結(jié)束時(DPI17)不感染對照組平均增重明顯高于臨床癥狀觀察組。 NORTON等[10]用1.28×106個巴氏艾美爾球蟲卵囊接種幼齡日本鵪鶉，僅出現(xiàn)輕微的食欲減退、糞便稀薄、體重減輕等臨床癥狀；而楊芷云等[6]用角田氏艾美爾球蟲卵囊接種8日齡鵪鶉時，1.0×103個卵囊即可致鵪鶉死亡。據(jù)本試驗結(jié)果，日本鵪鶉艾美爾球蟲致病力較角田氏艾美爾球蟲弱，但比巴氏艾美爾球蟲強。

3.2 日本鵪鶉艾美爾球蟲寄生部位內(nèi)生和發(fā)育過程

通過粘膜涂片觀察，日本鵪鶉艾美爾球蟲內(nèi)生發(fā)育階段主要在十二指腸；組織切片觀察，日本鵪鶉艾美爾球蟲裂殖生殖及配子生殖階段，蟲體主要寄生于鵪鶉十二指腸絨毛上皮細胞中，空腸前段亦有少量蟲體寄生，寄生部位腸絨毛上皮細胞發(fā)生顆粒變性和壞死，固有層有大量炎性細胞浸潤，腸道局部輕微出血和充血。根據(jù)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日本鵪鶉艾美爾球蟲在朝鮮龍城系鵪鶉內(nèi)生發(fā)育過程中可進行3代裂殖生殖，與BASHTAR等[11]對日本鵪鶉進行的球蟲內(nèi)生發(fā)育過程相一致。成熟裂殖體最早出現(xiàn)于感染后24 h，直到感染后102 h均可見處于不同發(fā)育時期的裂殖體。根據(jù)成熟裂殖體的形狀及裂殖體中所含裂殖子數(shù)量的多少，日本鵪鶉艾美爾球蟲存在2種類型的裂殖體。第1種成熟于感染后24～60 h，形狀不規(guī)則，每個裂殖體中含數(shù)個裂殖子；第2種成熟于感染后90～102 h，形狀規(guī)則，呈橢圓形或圓形，每個裂殖體中含數(shù)十個甚至上百個裂殖子；據(jù)出現(xiàn)時間推算，前者為第1代和第2代裂殖體，后者為第3代裂殖體。

3.3 日本鵪鶉艾美爾球蟲內(nèi)生發(fā)育過程中有世代并存現(xiàn)象

觀察組織切片時，發(fā)現(xiàn)有世代混雜現(xiàn)象，即有性繁殖與無性繁殖的蟲體同時存在，切片中可同時見到第3代裂殖體、大配子體、小配子體和卵囊。葛亮[12]觀察自然感染菲萊氏盲腸溫揚球蟲的內(nèi)生殖蟲體時，組織切片中可同時見到三型裂殖體、大配子體、小配子體和卵囊；RUFF等[3]試驗感染發(fā)現(xiàn)，日本鵪鶉艾美爾球蟲和角田氏艾美爾球蟲在鵪鶉體內(nèi)內(nèi)生發(fā)育階段參差不齊，發(fā)育上具有不同步現(xiàn)象；劉梅等[13]研究發(fā)現(xiàn)鵝球蟲在鵝體內(nèi)的內(nèi)生性發(fā)育過程中，至少經(jīng)過2個世代的裂殖生殖，其內(nèi)生階段世代并存現(xiàn)象不明顯。通常速發(fā)型子孢子侵入腸道上皮細胞后就開始發(fā)育成滋養(yǎng)體，繼之發(fā)育成為裂殖體、配子體和卵囊；而遲發(fā)型子孢子侵入腸道上皮細胞后，要經(jīng)過一段或長或短的休眠期后才發(fā)育為滋養(yǎng)體；球蟲子孢子在宿主體內(nèi)不同步發(fā)育造成了內(nèi)生殖階段存在不同世代并存現(xiàn)象。

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(責任編輯：蔣國良)

Experimental infection and endogenous development stages ofEimeriauzurain Japanese quail

ZHANG Min1， QI Meng2， LI Zhiyong1， WANG Cong3， WANG Fang4， MA Chaofeng5，ZHANG Longxian2， JIAN Fuchun2， NING Changshen2

(1.Jiaozuo Animal Disease Prevention and Control Center, Jiaozuo 454003, China； 2.Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China； 3.Jiaozuo Animal Husbandry Station, Jiaozuo 454003，China； 4.Henan Xinzhenghao Biological Engineering Co.， Ltd., Zhengzhou 450002, China； 5.Xinyang Animal Disease Prevention and Control Center, Xinyang 464000, China)

For the study ofEimeriauzuraendogenous development stages and pathogenicity, 8-day-old artificially-reared coccidian-free quails were inoculated orally with 1.0×105of sporulated oocysts ofE.uzura. The results show that the prepatent period was 5d and discharge of oocysts continued for 13 d. The incidence and mortality rate were 70.3% and 7.5%, respectively. The weight gain was affected significantly. Observation by tissue section showed thatE.uzuraparasitized mainly in the epithelial cells of duodenum and anterior jejunum. There were three merogony stages and one gamogony stage in the life ofE.uzura. The merogony and gamogony stage ofE.uzurapeaked at about 102 h and 114 h post-infection, respectively. The time of formingE.uzuraoocysts was at about 120 h post-infection. All endogenous stages developed in intestinal epithelial cells.E.uzuracould cause mild granular degeneration and necrosis in epithelial cells of the duodenum and a large number of inflammatory cell infiltration, congestion and hemorrhage in mucosa lamina propria. The results showed thatE.uzurawas medium pathogenic for quails.

Eimeriauzura; endogenous development; merogony; gamogony

2014-06-22

農(nóng)業(yè)部國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(nycytx-39)

張 敏(1980-)，女，河南溫縣人，獸醫(yī)師，碩士，從事動物疫病防控方面的研究。

寧長申(1958-)，男，河南郾城人，教授，博士生導(dǎo)師。

1000-2340(2015)03-0363-05

S852.723

A