高脂飼養(yǎng)兔和豚鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化模型比較

張夢(mèng)云，嚴(yán)光,方文祥,沈國(guó)棟

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 老年醫(yī)學(xué)科，b 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所)

·基礎(chǔ)研究·

高脂飼養(yǎng)兔和豚鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化模型比較

張夢(mèng)云1a，嚴(yán)光1a,方文祥1b,沈國(guó)棟2

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 老年醫(yī)學(xué)科，b 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所)

目的 比較高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月的日本大耳兔和豚鼠的血脂變化及動(dòng)脈粥樣硬化形成情況。方法 將12只兔和12只豚鼠分別采用數(shù)字表法隨機(jī)分成兩組，①兔對(duì)照組(n=6)：普通飼料喂養(yǎng)；②兔模型組(n=6)：高脂飼料喂養(yǎng)；③豚鼠對(duì)照組(n=6)：普通飼料喂養(yǎng)；④豚鼠模型組(n=6)：高脂飼料喂養(yǎng)。0周及4周末酶法檢測(cè)血脂;HE染色法觀察主動(dòng)脈弓病理變化。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)4周末兔模型組和豚鼠模型組血清低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均較對(duì)照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；病理結(jié)果示：兔模型組83%(5/6)可見動(dòng)脈粥樣硬化早期病理改變，豚鼠模型組未見動(dòng)脈粥樣硬化病理改變。結(jié)論 單純高脂飼料喂養(yǎng)1月，兔可形成高脂血癥和早期動(dòng)脈粥樣硬化，豚鼠只可形成高脂血癥，兔較豚鼠快速形成動(dòng)脈粥樣硬化模型。

動(dòng)脈粥樣硬化；模型,動(dòng)物;豚鼠；兔

動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未明確。探明發(fā)病機(jī)制、研究篩選有效治療藥物是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，而選擇合適有效的動(dòng)物模型則是上述研究的重要前提。一個(gè)理想的模型應(yīng)該是建模時(shí)間相對(duì)較短，重復(fù)性好，操作方便，同時(shí)應(yīng)與人相似的病理改變，兔[1-2]和豚鼠[3]則符合上述要求，但究竟我們?cè)谶x擇模型動(dòng)物時(shí)要選擇哪一種更為恰當(dāng)呢？國(guó)內(nèi)鮮有對(duì)此方面進(jìn)行比較，本文通過對(duì)比單位時(shí)間內(nèi)(1個(gè)月)高脂飼料飼養(yǎng)兔和豚鼠形成高脂血脂及早期動(dòng)脈粥樣硬化的成模率，為將來(lái)模型的選擇提供參考意見。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 選取健康日本大耳兔、豚鼠各12只(購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證編號(hào):scxk(魯)2014-0006。兔體質(zhì)量(2507.33±263.77)g，豚鼠體質(zhì)量(263.5±20.39)g，兔、豚鼠齡2～3月齡，兔單籠飼養(yǎng)，豚鼠分組飼養(yǎng)。12 h光照/黑暗，室溫控制于(24±1)℃，濕度45%～70%，通風(fēng)，防噪聲控制。飼料分為：普通兔/豚鼠飼料(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)和高脂兔/豚鼠飼料(膽固醇 1%+蛋黃粉 7.5%+豬油 8%+膽酸鈉 0.5%+0.1%丙硫氧嘧啶+81%普通兔/豚鼠飼料)。

1.2 主要儀器 日立7060型全自動(dòng)生化分析儀，LEICA EG1150H型組織包埋機(jī)，LEICA RM2235型石蠟切片機(jī),OLYMPUS生物顯微鏡

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，兔和豚鼠均采用隨機(jī)數(shù)字表法分成2組，兔分：對(duì)照組6只，普通飼料100 g/d；模型組6只，高脂飼料100 g/d；豚鼠分對(duì)照組6只，普通飼料自由飲食；模型組6只，高脂飼料自由飲食。上述動(dòng)物均自由飲水，每日給予少許新鮮蔬菜。

血脂測(cè)定：在各動(dòng)物入組前及實(shí)驗(yàn)4周末，禁食過夜后次日清晨，靜脈采血，采血后靜置1 h后離心(3000 r/min×10 min，4 ℃),分離血清，在日立7060型全自動(dòng)生化分析儀采用酶法檢測(cè)血清低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高脂血癥(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL) 。

標(biāo)本采集及處理：實(shí)驗(yàn)4周末，麻醉過量法處死動(dòng)物，縱向分離升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、降主動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈的整條主動(dòng)脈，縱向切開，觀察大體標(biāo)本病理改變后，置于10%福爾馬林中固定24 h后，乙醇梯度脫水，取主動(dòng)脈弓行石蠟包埋，4 μm切片后行HE染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察 適應(yīng)性喂養(yǎng)時(shí)，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物食欲、活動(dòng)量、精神狀態(tài)一般，毛色、二便正常，且各組間無(wú)明顯差異，高脂喂養(yǎng)1周時(shí)各組之間無(wú)明顯變化，第2周末兔模型組中5只出現(xiàn)進(jìn)食減少，活動(dòng)量減少，表情淡漠等表現(xiàn)，兔對(duì)照組無(wú)此表現(xiàn)；第3周末豚鼠模型組出現(xiàn)較豚鼠對(duì)照組進(jìn)食量減少，活動(dòng)量稍減少，表情稍淡漠等表現(xiàn)，4周初1只豚鼠出現(xiàn)肺部感染，經(jīng)抗感染治療無(wú)效，死亡。

2.2 體質(zhì)量 入組時(shí)(0周)兔及豚鼠對(duì)照組與模型組間體質(zhì)量相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，4周末兔對(duì)照組體質(zhì)量較兔模型組偏低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，豚鼠對(duì)照組較豚鼠模型組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組體質(zhì)量均值比較(g)

注：4周初豚鼠模型組中1只死亡，僅存5只；與對(duì)照組比較，aP<0.05

2.3 血脂 入組時(shí)(0周)兔及豚鼠對(duì)照組與模型組間TC、TG、LDL-C、HDL-C、VLDL-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)4周末兔模型組TC、LDL-C、HDL-C、VLDL-C均顯著升高，分別為健康對(duì)照組的17.7、29.2、4.2、25.8倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組TG為對(duì)照組1.2倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；豚鼠模型組TC、LDL-C、HDL-C均顯著升高，分別為對(duì)照組的8.8、4.3、7.9倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組TG、VLDL-C為對(duì)照組1.8、1.3倍升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2，3。

表2 兔實(shí)驗(yàn)前后血脂變化

注：4周初豚鼠模型組中1只死亡，僅存5只；與對(duì)照組比較，aP<0.05

表3 豚鼠實(shí)驗(yàn)前后血脂變化(mmol/L)

注：4周初豚鼠模型組中1只死亡，僅存5只；與對(duì)照組比較，aP<0.05

2.4 病理形態(tài)學(xué)變化 肉眼觀兔對(duì)照組全組主動(dòng)脈質(zhì)韌，全程內(nèi)膜光滑、連續(xù)，未見異常改變；兔模型組中5只出現(xiàn)主動(dòng)脈質(zhì)脆、厚薄不均，內(nèi)膜可見脂紋形成，1只未見明顯異常改變；豚鼠對(duì)照組及模型組均未見明顯異常改變。HE染色后光學(xué)顯微鏡下見兔及豚鼠對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密，中膜由多層整齊排列的平滑肌細(xì)胞組成，細(xì)胞核多呈梭形(如圖1,2)。兔模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜及管壁明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)及聚集增加，大量的泡沫細(xì)胞聚集成斑塊,斑塊內(nèi)可見鈣鹽沉積，部分可見纖維帽形成(如圖3)；豚鼠模型組動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)，無(wú)單核巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)聚集，無(wú)泡沫細(xì)胞聚集等動(dòng)脈粥樣硬化改變(如圖4)。

3 討論

目前研究常用的動(dòng)物模型有兔、鼠、豬、非人靈長(zhǎng)類、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等，大鼠有抗AS的特性，且與人類脂質(zhì)代謝方式不一樣而很少應(yīng)用；豬和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類的系統(tǒng)發(fā)育和飲食結(jié)構(gòu)相似，且有自發(fā)形成AS，是較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但其來(lái)源困難、費(fèi)用昂貴和造模時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)而不能廣泛應(yīng)用；兔在脂質(zhì)代謝方面與人類有一些相似之處，對(duì)高脂飼料敏感，是研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制及治療藥物最常應(yīng)用的動(dòng)物[4-5]；然而近幾年研究發(fā)現(xiàn)豚鼠與人類的脂代謝過程有許多相似之處，都是通過LDL攜帶和轉(zhuǎn)運(yùn)大部分膽固醇的動(dòng)物，其血漿脂質(zhì)構(gòu)成、膽固醇和脂蛋白的代謝方式與人類極為類似，豚鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后肝臟?；o酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)和血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)活性增強(qiáng)，這些均與人的變化相似[6-7]，故認(rèn)為豚鼠也是AS較理想的動(dòng)物模型。

本實(shí)驗(yàn)通過定期飼養(yǎng)兔和豚鼠1月，檢測(cè)血脂及主動(dòng)脈病理變化，比較兩種模型動(dòng)物的成模率及特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示實(shí)驗(yàn)4周后兔模型組TC、TG、LDL-C、HDL-C分別為對(duì)照組的17.7、1.2、29.2、4.2倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，83%(5/6)的兔模型病理結(jié)果示早期動(dòng)脈粥樣硬化，豚鼠模型組TC、LDL-C、HDL-C均顯著升高，分別為對(duì)照組的8.8、4.3、7.9倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，病理結(jié)果未見早期動(dòng)脈粥樣硬化形成。故我們認(rèn)為在此配方的高脂飼料喂養(yǎng)1月，兔形成高脂血癥，成模率為100%，早期動(dòng)脈粥樣硬化成模率為83%(5/6)；豚鼠也可形成高脂血脂，且成模率為100%，未能形成早期動(dòng)脈粥樣硬化模型。

我國(guó)研究者在做相關(guān)研究時(shí)多以不同高脂飼料配比飼養(yǎng)兔數(shù)月，豚鼠則通常單純高脂飼養(yǎng)8～10周之后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定和病理結(jié)果測(cè)定，如聯(lián)合球囊內(nèi)膜剝脫術(shù)或者免疫損傷則通常飼養(yǎng)8～10周[8-11]，但是球囊內(nèi)膜剝脫術(shù)手術(shù)復(fù)雜，術(shù)后死亡率較高，免疫損傷增加意外死亡風(fēng)險(xiǎn)，而且機(jī)械性內(nèi)膜損傷和外源性免疫損傷不符合人體動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制。李琳等[1]應(yīng)用配方為2%的膽固醇+10%豬油+0.2%丙硫氧嘧啶+87.8%普通飼料的高脂飼料喂養(yǎng)日本大耳兔10周，病理結(jié)果示早期動(dòng)脈粥樣硬化，與本實(shí)驗(yàn)比較可見延長(zhǎng)對(duì)兔高脂喂養(yǎng)時(shí)間，血脂及動(dòng)脈粥樣硬化病變都進(jìn)一步發(fā)展，但血脂升高速度相對(duì)減慢；楊潤(rùn)梅等[6]應(yīng)用高脂飼料(0.5%的膽固醇+10%豬油+89.5%普通飼料)喂養(yǎng)豚鼠10周后測(cè)定豚鼠血清TC，為健康對(duì)照組的9.7倍，病理結(jié)果示早期動(dòng)脈粥樣硬化形成。與本實(shí)驗(yàn)相比，豚鼠都出現(xiàn)高脂血癥結(jié)果一致，但在本實(shí)驗(yàn)高脂配比下飼養(yǎng)1月，未見動(dòng)脈粥樣硬化形成，如需建立動(dòng)脈粥樣硬化模型則需進(jìn)一步延長(zhǎng)飼養(yǎng)時(shí)間。

綜上所述，兔在脂質(zhì)代謝方面和人類有一些相似之處，單純高脂飼料喂養(yǎng)符合人類動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程，本實(shí)驗(yàn)配比的高脂飼料喂養(yǎng)1月，形成高脂血癥和早期動(dòng)脈粥樣硬化。在早期動(dòng)脈粥樣硬化病理生理機(jī)制及藥物治療效果、選擇等研究中，為節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本及時(shí)間，避免不必要的飼養(yǎng)時(shí)間可以選擇兔為模型動(dòng)物；豚鼠血漿脂質(zhì)構(gòu)成、膽固醇和脂蛋白的代謝方式與人類極為相似，但是單純高脂飼料喂養(yǎng)1月，只可形成高脂血癥，長(zhǎng)時(shí)間喂養(yǎng)增加動(dòng)物意外死亡風(fēng)險(xiǎn)，如實(shí)驗(yàn)時(shí)間充裕、資金充足的研究者可以選擇豚鼠為模型動(dòng)物。

(本文圖1～4見插圖5-1)

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Atherosclerosis model comparsion between rabbits and guinea pigs feed by high fat diet

ZhangMengyun*,YanGuang,FangWenxiang,ShenGaodong

(*DepartmentofGeriatrics,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

YanGuang,Email:yanguang399@sina.com

Objective To compare lipid changes and atherosclerosis of Japanese white rabbits and guinea pigs feed by high fat diet.Methods Twelve Japanese white rabbits and twelve guinea pigs were randomly divided into 2 groups respectively,1.Rabbit control group (n=6):chow diet;2.Rabbit model group (n=6):high fat diet;3.Guinea pig control group (n=6):chow diet;4.Guinea pig model group (n=6):high fat diet.Serum lipid were measured by enzymatic at 0 week and 4weeks.Aorta pathological changes were observed by HE staining.Results The total cholesterol,triglyceride,low density lipoprotein and high density lipoprotein of model groups were significantly higher than those in the control groups(P<0.05),and the difference was statistically significant.Pathology results showed that early stage pathological changes of atherosclerosis was founded in 83%(5/6) of rabbit model group,however there was no atherosclerosis in guinea pig model group.Conclusion Simple fed high-fat diet for 1month,rabbits will have hyperlipidemia and early atherosclerosis,while guinea pigs only with hyperlipidemia.The model of atherosclerosis could format repidly in rabbit compared with guinea pig.

Atherosclerosis;Models,animal;Guinea pigs；Rabbits

安徽省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(11030603025)

張夢(mèng)云，碩士在讀，Email：272423119@qq.com

嚴(yán)光，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email:yanguang399@sina.com

R543.5

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.017

2015-05-10)