低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲復合作用下大鼠血清的代謝組學研究

王慶蓉，沈先榮，何穎，劉玉明，李珂嫻，陳偉，蔣定文，侯登勇

低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲復合作用下大鼠血清的代謝組學研究

王慶蓉，沈先榮，何穎，劉玉明，李珂嫻，陳偉，蔣定文，侯登勇

目的探討低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲有害環(huán)境因素復合作用對大鼠血清代謝產物的影響，探討復合環(huán)境因素導致機體損傷的機制。方法健康成年SD大鼠16只，隨機分為正常對照組(不做任何處理)和實驗組(每日接受低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲的復合作用，共7d)，每組8只。實驗結束時腹主動脈取血，分離大鼠血清，采用核磁共振氫譜(1H NMR)儀檢測兩組大鼠血清樣本，得到代謝指紋圖譜，采用主成分分析(PCA)和正交信號校正-偏最小二乘(OSC-PLS)法進行模式識別，并通過SIMCA-P軟件鑒別兩組代謝產物譜的差異。結果大鼠血清1H NMR圖譜分析顯示對照組和實驗組的代謝譜存在明顯差異，OSC-PLS分析顯示兩組代謝產物各自聚集，分布區(qū)域明顯分開。與對照組比較，實驗組血清中脂類、高密度脂蛋白、甘氨酸/葡萄糖、N-乙酰糖蛋白1、N-乙酰糖蛋白2、磷脂酰膽堿和不飽和脂肪酸含量增加，乳酸、蘇氨酸/脂質、丙氨酸、肌酸、甘磷酸膽堿/氧化三甲胺、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和飽和脂肪酸含量下降。結論低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲有害環(huán)境因素復合作用使大鼠血清代謝產物發(fā)生變化，主要涉及免疫功能、腎功能和能量代謝?；诤舜殴舱竦拇x組學方法可用于研究多種有害環(huán)境因素的復合生物效應，具有較好的應用前景。

輻射損傷；一氧化碳；苯；噪聲；代謝組學

某些特殊作業(yè)環(huán)境中同時存在多種有害理化因素，這些因素復合作用于人體會對健康造成一定影響。動物實驗表明，一些復合環(huán)境因素產生的生物效應較為復雜，既有拮抗作用，也存在協(xié)同作用[1-4]，但上述研究主要集中在動物組織器官病理變化、生理生化指標變化及細胞水平的改變方面，對復合環(huán)境因素作用機制的研究尚不夠深入。代謝組學技術可通過系統(tǒng)研究代謝產物的變化規(guī)律，揭示機體生命活動代謝的本質[5-6]。機體受到體外因素刺激發(fā)生變化的過程中，會影響機體的代謝過程，使機體細胞產生的內源性物質的濃度、種類和比例發(fā)生改變，并最終體現(xiàn)為血液、尿液等體液中小分子代謝產物集合輪廓的變化。目前已可采用多種譜學技術建立代謝產物指紋圖譜來反映該變化并進一步挖掘譜圖的隱含信息，從而使從代謝組學角度闡明復合環(huán)境因素影響機體健康的微觀本質成為可能。本研究應用基于核磁共振(NMR)技術的代謝組學方法，從小分子代謝產物水平探討低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲有害環(huán)境因素復合作用的機制，發(fā)現(xiàn)一些小分子代謝產物發(fā)生了異常變化，可作為上述環(huán)境因素復合作用于機體的生物標志物，為進一步采取有效防護措施提供靶點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 美國瓦里安公司(Varian，Inc.)INOVA 600MHz超導核磁共振譜儀，配備脈沖場梯度，帶梯度場的三共振探頭。離心機(德國Eppendorf MiniSpin Plus)。重水(D2O，美國Cambridge Isotope Laboratories公司，99.9%)。3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉(TSP，德國Merck公司)。

1.2 動物分組與處理 健康成年雄性SD大鼠16只，體重200～250g，購自第二軍醫(yī)大學動物中心。SD大鼠隨機分為實驗組和正常對照組，每組8只。采用蘇州大學醫(yī)學部的全自動動態(tài)染毒裝置，將實驗組大鼠暴露于CO(230ppm)和苯(20ppm)混合氣體中，每天固定時間染毒4h，隨后同時進行輻照和噪聲暴露。輻照采用60Co放射源和252Cf源照射，低劑量γ照射1h，低劑量中子照射20h，照射劑量率分別為0.072Gy/h和0.085mGy/h。噪聲暴露采用反應堆周圍機械噪聲錄音重放，暴露動物區(qū)聲音強度90±5dB，每天暴露2h。實驗組動物連續(xù)處理7d。正常對照組動物不進行任何處理。

1.3 血清樣本制備 實驗結束時剖殺動物，腹主動脈取血，常規(guī)分離血清，4℃下3000r/min離心10min，取上清1.5ml至離心管，向管中依次加入含100μl TSP的重水溶液(1mg/ml)、300μl血清以及200μl重水，充分振蕩混勻后14 000r/min離心10min，取550μl上清加入5mm核磁共振管中待用。

1.4 NMR數(shù)據(jù)采集 分別采用弛豫編輯脈沖序列[CPMG脈沖序列，-RD-90°-(-180°-)n-ACQ]和擴散編輯脈沖序列(LEDbpp脈沖序列，-RD-90°-G1-180°-G1-90°-T-90°-G1-180°-G1-90°-90°-ACQ)采集血清樣本的數(shù)據(jù)，以觀測血清中的小分子代謝產物和脂類代謝產物。CPMG實驗的譜寬為8000Hz，采樣點數(shù)64k，采樣時間4s，累加次數(shù)64次，τ為200μs，2nτ 為320ms，弛豫延遲為2s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。LEDbpp實驗的譜寬為8000Hz，采樣點數(shù)64k，采樣時間4s，累加次數(shù)64次，擴散時間為100ms，τ為5ms，弛豫延遲為2s，其間采用低功率脈沖對水峰進行預飽和。在對自由感應衰減(free induction decay，F(xiàn)ID)信號數(shù)據(jù)進行填零，分別加上1Hz(CPMG實驗)和3Hz(LEDbpp實驗)的線增寬因子后進行傅立葉變換得到1H NMR譜圖。以乳酸甲基信號雙峰的左側峰定標為1.33。

1.5 NMR數(shù)據(jù)處理 對所得NMR數(shù)據(jù)經傅立葉變換得到譜圖，然后調整相位并進行基線校正。對CPMG數(shù)據(jù)，將0.4～4.4范圍內的譜按照每段0.04ppm進行分段積分。對LED數(shù)據(jù)，將0～6.0范圍內的譜按照每段0.04ppm進行分段積分，并將4.6～5.0之間的譜排除。將積分按每張譜的總積分強度歸一化。

1.6 統(tǒng)計學處理 將檢測所得數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P+軟件(V10.04，Umetrics，Ume?，Sweden)進行多元統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用平均中心化(mean centering) 或Pareto標度化(Pareto scaling)進行預處理之后進行主成分分析(PCA)。必要時可對數(shù)據(jù)采用正交信號校正(orthogonal signal correction，OSC)處理，然后再進行偏最小二乘(PLS)分析。分析結果以得分圖(scores plot)和載荷圖(loadings plot)的形式表示。

2 結 果

2.1 大鼠血清樣本的1H NMR譜圖 正常對照組和實驗組大鼠血清樣本的弛豫編輯(圖1)和擴散編輯(圖2)1H NMR譜圖中波峰有明顯差異，提示兩組大鼠血清小分子代謝產物和脂類代謝產物成分有明顯差異。

圖1 大鼠血清樣本弛豫編輯(CPMG)1H NMR圖譜Fig.11H NMR CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) spectra of rats serum A. Control group; B. Exposed group

圖2 大鼠血清樣本擴散編輯(LED)1H NMR圖譜Fig.21H NMR LED (longitudinal eddy-delay) spectra of rats serumA. Control group; B. Exposed group

2.2 CMPG1H NMR模式識別 正常對照組和實驗組大鼠血清樣品CMPG1H NMR譜的OSC-PLS分析結果如圖3所示。模型參數(shù)R2X(cum)=44.6%，R2Y(cum)=96.3%，Q2(cum)=76.4%。對應的得分圖(圖3A)的積分值集中分布于散點圖的橢圓內(95%可信區(qū)間)，說明模型擬合效果好，兩組的分布區(qū)域基本能區(qū)分開來。對應的載荷圖(圖3B)顯示，與正常對照組比較，實驗組大鼠血清中脂類、甘氨酸/葡萄糖含量增加，乳酸、蘇氨酸/脂質、丙氨酸、肌酸、甘油磷脂酰膽堿/氧化三甲胺含量降低(表1)。

圖3 實驗組(■)和正常對照組(▲)大鼠血清弛豫時間編輯(CPMG)1H NMR圖譜的OSC-PLS分析結果Fig. 3 OSC-PLS analysis of serum from exposed group (■) and control group (▲) based on1H NMR CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) spectra A. Score plot; B. Loading plot. R2X(cum)=44.6%; R2Y(cum)=96.3%; Q2(cum)=76.4%

2.3 LED1H NMR模式識別 正常對照組和實驗組大鼠血清樣品LED1H NMR譜的PLS-DA分析結果如圖4所示。模型參數(shù)R2X(cum)=73.9%，R2Y(cum)=98.5%，Q2(cum)=97.1%。對應的得分圖(圖4A)的積分值集中分布于散點圖的橢圓內(95%可信區(qū)間)，說明模型擬合效果好，兩組的分布區(qū)域完全分開。對應的載荷圖(圖4B)顯示，與正常對照組比較，實驗組大鼠血清中高密度脂蛋白、N-乙酰糖蛋白1、N-乙酰糖蛋白2、不飽和脂肪酸、磷脂酰膽堿含量增加，低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白、極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、飽和脂肪酸含量降低(表2)。

表1 大鼠血清小分子代謝產物濃度變化Tab.1 Concentration change of micromolecular metabolites in rats serum

3 討 論

本研究采用1H NMR技術對低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲復合環(huán)境因素暴露下的大鼠血清進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，復合環(huán)境因素暴露組與正常對照組的血清代謝產物譜存在顯著差異，多種代謝成分發(fā)生了變化。1H NMR模式識別的得分圖顯示實驗組與正常對照組代謝產物分布的區(qū)域可完全分開，說明該模型可區(qū)分復合環(huán)境因素暴露組與正常對照組，代謝組學技術是開展復合環(huán)境因素生物效應及作用機制研究的有效手段。

圖4 實驗組(■)和正常對照組(▲)血清擴散編輯(LED)1H NMR圖譜的OSC-PLS分析結果圖Fig. 4 OSC-PLS analysis of serum from exposed group (■) and control group (▲) based on1H NMR LED (longitudinal eddydelay) spectraA. Score plot; B. Loading plot. R2X(cum)=73.9%; R2Y(cum)=98.5%; Q2(cum)=97.1%

表2 大鼠血清脂類代謝產物濃度變化Tab. 2 Concentration change of lipid metabolites in rats serum

本研究結果顯示，實驗組血清中甘氨酸/葡萄糖含量增加，乳酸、肌酸含量降低，說明復合環(huán)境因素導致大鼠糖代謝發(fā)生紊亂，糖酵解過程被抑制。乳酸是糖酵解過程正常代謝產物，也是體內三羧酸循環(huán)的中間產物，在缺氧條件下在乳酸脫氫酶的催化下由丙酮酸生成，維持機體正常的能量代謝[7]。肌酸是體內細胞能量代謝的中間產物。低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲復合環(huán)境因素作用下乳酸和肌酸含量的變化提示機體能量代謝發(fā)生異常。實驗組血清中脂類、磷脂酰膽堿、高密度脂蛋白(HDL)含量增加，低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)含量降低，提示機體脂代謝發(fā)生了變化。磷脂酰膽堿是位于細胞膜上的磷脂，可作為一種貯存的脂類來源，也可在體內將血液中的膽固醇和脂肪酸乳化為極細的顆粒從血管中排出。復合環(huán)境導致大鼠血清中磷脂酰膽堿含量增加，進一步提示機體脂代謝發(fā)生了變化。

丙氨酸是體內重要的非必需氨基酸，有研究顯示丙氨酸是淋巴細胞再生及免疫過程中重要的參與者[8]。N-乙酰糖蛋白是急相反應時血清中檢測到的糖蛋白，其含量變化反映了免疫系統(tǒng)的炎癥反應[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，復合環(huán)境因素作用下，大鼠血清中丙氨酸含量降低，N-乙酰糖蛋白含量增加，提示低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲的復合作用造成了機體的免疫功能受損。

氧化三甲胺、甘氨酸、膽堿類衍生物如磷脂酰膽堿、甘磷酸膽堿是甲胺類物質代謝循環(huán)的中間產物或其衍生物，對維持腎臟功能具有重要作用[12]。膽堿類衍生物是腎髓質的主要細胞滲透調節(jié)物，其含量變化提示腎臟代謝紊亂。有研究發(fā)現(xiàn)，在腎細胞癌患者體內此類有機滲透調節(jié)物含量存在異常[13]。氧化三甲胺也是一種反映腎臟慢性病變的生物標志物[14]，本研究中實驗組大鼠血清內氧化三甲胺含量變化說明腎臟功能出現(xiàn)障礙。此外，氧化三甲胺與腸道菌群也有密切關系，其含量變化也提示復合環(huán)境因素可導致機體腸道菌群結構發(fā)生變化。

綜上所述，本研究結果提示，低劑量電離輻射、一氧化碳、苯和噪聲有害環(huán)境因素對機體的復合作用可能與免疫功能受損、腎功能受損、能量代謝異常有關。長期暴露于多種有害環(huán)境因素的職業(yè)人群，其健康可能因多種環(huán)境因素復合作用導致機體代謝紊亂而受損，因此，在采取防護措施和制定行業(yè)衛(wèi)生標準時，應充分考慮環(huán)境因素的復合效應。

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Study on serum metabonomics of rats exposed to low-dose ionizing radiation, carbon monoxide, benzene and noise

WANG Qing-rong, SHEN Xian-rong*, HE Ying, LIU Yu-ming, LI Ke-xian, CHEN Wei, JIANG Ding-wen, HOU Deng-yong
Naval Medical Research Institute of PLA, Shanghai 200433, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: xianrong_sh@163.com

, E-mail: xianrong_sh@163.com
This work was supported by the Science Technology Program of the General Logistics Department of PLA (AHJ09J012) and the Tackle Key Problems in Science Technology Program of the General Logistics Department of PLA (2009183006)

ObjectiveTo investigate the combined effects of low-dose ionizing radiation, carbon monoxide, benzene and noise on serum metabolites and the mechanism of injury induced by these complex environmental factors in rats.MethodsSixteen adult SD rats were randomly divided into control group and exposed group (8 each). The exposed group

the combined effect every day for 7 days. At the end of experiment, sera were collected from the abdominal aorta of rats. The metabolic fingerprint of serum was obtained by1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy and determined with pattern recognition techniques of principal component analysis (PCA) and orthogonal signal correction-partial least squares (OSC-PLS). The similarities and differences in metabolic profiles between two groups were visualized by SIMCA-P software.ResultsThe rat serum1H NMR spectra revealed different metabolic spectra between the control group and exposed group. The OSC-PLS plots of the serum samples presented respectively marked clustering between the two groups. Compared with the control group, the contents of lipid, high density lipoprotein, glycine/glucose, N-acetyl glycoprotein 1, N-acetyl glycoprotein 2, phosphatidyl choline and unsaturated fatty acid increased, while those of lactic acid, threonine/lipid, alanine, creatine, glycerylphosphorylcholine/ trimethylamine oxide, low density lipoprotein/high density lipoprotein, low density lipoprotein, very low density lipoprotein/ low density lipoprotein, very low density lipoprotein and saturated fatty acid decreased.ConclusionsCombination of low-dose ionizing radiation, carbon monoxide, benzene and noise could induce changes of serum metabolites in rats, involving in immunefunction, renal function and energy metabolism. The NMR-based-metabonomics method has potential of application in research on combined biological effects of the complex environmental factors.

radiation injuries; carbon monoxide; benzene; noise; metabolomics

R148；R135

A

0577-7402(2015)07-0559-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.09

2014-12-27；

2015-01-15)

(責任編輯：李恩江)

全軍后勤科研計劃項目(AHJ09J012)；總后科技攻關項目(2009183006)

王慶蓉，高級實驗師。主要從事輻射生物效應與醫(yī)學防護方面的研究

200433 上海 海軍醫(yī)學研究所(王慶蓉、沈先榮、何穎、劉玉明、李珂嫻、陳偉、蔣定文、侯登勇)

沈先榮，E-mail：xianrong_sh@163.com