電針聯(lián)合飲食控制對(duì)胰島素抵抗模型大鼠 InsR和 P90rsk蛋白表達(dá)的影響

唐念珍，唐成林*，唐思詩，楊 輝，張 毅，田 源，袁海洲，曹 凈，高睿琦

（1．重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2．重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，重慶400016）

電針聯(lián)合飲食控制對(duì)胰島素抵抗模型大鼠 InsR和 P90rsk蛋白表達(dá)的影響

唐念珍1，唐成林1*，唐思詩2，楊 輝3，張 毅1，田 源1，袁海洲1，曹 凈1，高睿琦1

（1．重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016；2．重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，重慶400016）

目的 研究電針聯(lián)合飲食控制對(duì)胰島素抵抗模型大鼠InsR和P90rsk蛋白表達(dá)的影響，探討其增強(qiáng)胰島素抵抗模型大鼠對(duì)胰島素敏感性的機(jī)制。方法 SD雄性大鼠70只，隨機(jī)分為普食組（n＝10）和高脂高糖組（n＝60），分別給予普通飲食及高脂高糖飲食。8周后選取40只成功造模的大鼠隨機(jī)分為：HFHCD 1、HFHCD 2、EA 1、EA 2組（n＝10）。HFHCD 1組和EA 1組高脂高糖飲食，HFHCD 2組和EA 2組普食。EA組針刺1次／d，20 min／次，共14 d。觀察大鼠體質(zhì)量、血糖和胰島素變化情況，Western blot檢測(cè)各組大鼠InsR和P90rsk的蛋白表達(dá)量。結(jié)果 InsR和P90rsk蛋白表達(dá)：HFHCD組較CD組明顯降低（P＜0.01），EA組較HFHCD組明顯升高（P＜0.01），HFHCD 2組較HFHCD 1組、EA 2組較EA 1組均明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論 電針聯(lián)合飲食控制能升高InsR和P90rsk蛋白表達(dá)水平，從而恢復(fù)胰島素信號(hào)的正常傳導(dǎo) ，增強(qiáng)胰島素敏感性。

針灸療法 ；飲食控制；胰島素抵抗；InsR；P90rsk

胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是指生理劑量的胰島素所產(chǎn)生的效應(yīng)低于其正常量產(chǎn)生的生理效應(yīng)。研究［1］證實(shí)，IR是肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征、冠心病等疾病的病理基礎(chǔ)。胰島素受體（Insulin Receptor，InsR）是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要因子，胰島素首先要與其結(jié)合才能激活其下游效應(yīng)因子，其數(shù)量的減少和（或）活性的降低都會(huì)影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的正常傳導(dǎo)，降低胰島素的生理效應(yīng)，導(dǎo)致胰島素抵抗［2］。核糖體S6蛋白激酶（Ribosomal S6 kinase，P90rsk）是絲裂原激活蛋白激酶的下游底物 ，可被其磷酸化而激活 ，進(jìn)而磷酸化糖原合成酶激酶－3（GSK－3），糖原合成 ，血糖降低［3］。目前中醫(yī)采用電針治療本病已較為多見，而對(duì)其治療機(jī)制研究較少，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)比觀察電針聯(lián)合飲食控制干預(yù)對(duì)IR模型大鼠InsR和P90rsk蛋白表達(dá)的影響，探討其控制增強(qiáng)IR模型大鼠對(duì)胰島素敏感性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型建立 70只清潔級(jí)雄性SD大鼠 ，4周齡 ，體質(zhì)量（90±10）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)學(xué)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）2012－ 0002。隨機(jī)選取10只為普食組（common diet group，CD，n＝10），余下60只為高脂高糖組（high－fat and high－carbohydrate diet group，HFHCD，n＝60）。飼料配方為：100 g高脂高糖飼料＝60 g普通基礎(chǔ)飼料＋25 g蔗糖＋15 g豬油［4］。從第5周開始 ，每周CD組和HFHCD組大鼠采血1次，檢測(cè)FPG、INS，并計(jì)算ISI＝1／（空腹血糖×空腹胰島素）［5］。8周后 ，與CD組比較，F(xiàn)PG、INS顯著升高（P＜0.05），ISI顯著下降（P＜0.05）為IR模型大鼠造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，最終得到模型大鼠44只。從中隨機(jī)選取40只分為高脂高糖1組（HFHCD 1），高脂高糖2組（HFHCD 2），電針1組（electroacupuncture 1，EA 1），電針2組（electroacupuncture 2，EA 2），n＝10。CD組、HFHCD 2組、EA 2組普食喂養(yǎng)，HFHCD 1組、EA 1組高脂高糖飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 主要試劑：葡萄糖測(cè)定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)公司）；大鼠胰島素ELISA試劑盒（美國R&D公司）；Ⅰ抗：InsR抗體和P90rsk抗體（上海sab公司）；Ⅱ抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體（北京中杉生物公司）。主要儀器：Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BlO－Rad）；DYY－6C電泳儀（北京六一儀器廠）；DU640核酸蛋白分析儀（美國Backman公司）；華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；華佗牌SDZ－Ⅱ型電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.3 針刺方法 針刺雙側(cè)后三里、三陰交（均斜刺5 mm），胃脘下俞（斜刺3 mm），同側(cè)后三里和胃脘下俞電刺激20 min，連續(xù)治療14 d。電針參數(shù)［6］：疏密波，疏波頻率4 Hz，密波頻率20 Hz，3 mA。穴位定位［7］：后三里位于后肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè) ，在腓骨小頭下約5 mm；三陰交位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm；胃脘下俞位于背部第8胸椎棘突下，旁開5 mm。其余3組以同等條件固定20 min，無治療。

1.4 標(biāo)本采集 大鼠禁食過夜，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL／100 g）進(jìn)行麻醉，注射器直接刺入心臟取血2～3 mL，3 000 r／min離心10 min，取上層血清置于－20℃冰箱待測(cè)。用空氣栓塞法處死大鼠，迅速分離股四頭肌置于液氮罐中，轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱中待測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 稱量大鼠體質(zhì)量 每周固定時(shí)間由同一人員稱量各組大鼠體質(zhì)量并記錄。

1.5.2 葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖濃度 取3支潔凈的試管分別標(biāo)記為Ⅰ管 （空白管）、Ⅱ管 （標(biāo)準(zhǔn)管）、Ⅲ管 （測(cè)定管），各管先加入酶酚混合試劑3 mL，然后Ⅰ管加蒸餾水0.02 mL，Ⅱ管加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.02 mL，Ⅲ管加血清0.02 mL。充分混勻后置于37℃水浴15 min，在波長505 nm下測(cè)定Ⅱ管和Ⅲ管的吸光度值 （A）。計(jì)算方法 ：血清葡萄糖（mmol／L） ＝ （AⅢ／AⅡ） ×5。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)空腹胰島素濃度 提前20 min將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用。按照表1所示加入各內(nèi)容物。然后蓋上封板膜，混勻后在37℃下溫育60 min。揭掉封板膜，倒掉液體 ，用配置好的洗滌液重復(fù)洗板5次。每孔再加入顯色液A、B各50 μL，混勻后37℃避光顯色10 min。最后每孔再加入終止液50 μL，震蕩混勻后在450 nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），以空白孔調(diào)零，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算樣品濃度。見表1。

表1 酶聯(lián)免疫吸附法加樣表 μL

1.5.4 Western Blot檢測(cè)InsR和P90rsk蛋白表達(dá)量取股四頭肌約40 mg，加入配制好的緩沖液0.4 mL，充分勻漿攪碎，冰上裂解，離心后取上清；配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白液，測(cè)定蛋白濃度；加入緩沖液100 μL，煮沸6 min。根據(jù)蛋白濃度計(jì)算出所需上樣量為50 μg，電泳，轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于95%乙醇中固定后自然晾干，1%PBST洗5 min，放入5%脫脂奶粉中封閉，37℃恒溫?fù)u床下4 h；加I抗體（1∶1 000），37℃恒溫?fù)u床下3 h，1%PBST洗3次；加 HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫1 h，1%PBST洗3次；用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，在暗室中使X線片爆光，顯影，定影，并掃入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值代表InsR和P90rsk在標(biāo)本中的蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，采以Duncan檢驗(yàn)比較多組間的均數(shù)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量的比較 見表2。

表2 電針治療前后胰島素抵抗模型大鼠體質(zhì)量變化的比較（ˉx±s，n＝10）g

2.2 電針對(duì)大鼠FPG、INS、ISI的影響 見表3。

注 ：與CD組比較 ，＃＃P＜0.01；與 HFHCD 1組比較 ：△△P＜0.01；與HFHCD 2組比較 ，▲▲P＜0.01；與EA 1組比較 ：★★P＜0.01

2.3 電針對(duì)大鼠骨骼肌InsR和P90rsk蛋白表達(dá)的影響 見表4，圖1。

表4 電針聯(lián)合飲食控制對(duì)胰島素抵抗模型大鼠InsR和P90rsk蛋白表達(dá)的影響比較（ˉx±s，n＝10）

圖1 電針聯(lián)合飲食控制對(duì)胰島素抵抗模型大鼠InsR和P90rsk蛋白表達(dá)的影響比較

3 討論

胰島素的正常生理效應(yīng)主要是通過兩條信號(hào)途徑來實(shí)現(xiàn)的，一是IR－IRS－PI3K途徑，另一條是MAPK途徑。胰島素與其受體InsR結(jié)合后，可激活Grb2／SOS，活化RAS蛋白，使MAPK得以激活，進(jìn)而使其下游底物P90rsk活化，其可促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（GLUT4）通過易位作用使葡萄糖轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，使其被攝取利用，血糖降低；P90rsk還可磷酸化GSK－3而使其失活，糖原合成酶恢復(fù)活性而促使糖原合成 ，血糖降低［8－10］。

電針可以降低血糖水平，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性［11］，調(diào)節(jié)胰島素的分泌 ，降低血脂 ，減少肝脂肪堆積和變性 ，阻止胰腺功能惡化［12］。本課題組前期研究［13］也已證實(shí) ，電針可影響IR－IRS－PI3K途徑的傳導(dǎo)，為更進(jìn)一步完善電針改善胰島素抵抗的機(jī)制，故本實(shí)驗(yàn)通過觀測(cè)MAPK途徑的主要效應(yīng)因子InsR和P90rsk蛋白表達(dá)水平的變化，探討電針改善胰島素抵抗的機(jī)制。

FPG、INS、ISI結(jié)果顯示，連續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，HFHCD組大鼠體內(nèi)INS較CD組明顯升高（P＜0.05），而其FPG卻并未顯著降低，說明大鼠機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性降低，而治療干預(yù)后EA組較HFHCD組FPG、INS均顯著降低，說明機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性得以提升。InsR和P90rsk蛋白表達(dá)量結(jié)果顯示，機(jī)體發(fā)生IR后其表達(dá)量顯著降低，即HFHCD組顯著低于CD組（P＜0.05），造成葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、糖原合成減少 ，使血糖升高，而電針治療和（或）飲食控制對(duì)其表達(dá)量的影響十分顯著，即EA組顯著高于HFHCD組（P＜0.05），從而改善了骨骼肌葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及增加了糖原的合成量，使血糖降低。

綜上所述，電針聯(lián)合飲食控制能夠增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，其機(jī)制之一可能是通過提高InsR和P90rsk蛋白表達(dá)水平，從而達(dá)到其治療作用。

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Effect of electroacupunctrue and alimentary control on content of InsR and P90rskprotein in insulin resistance rat

TANG Nianzhen1，TANG Chenglin1*，TANG Sishi2，YANG Hui3ZHANG Yi1，TIAN Yuan1，YUAN Haizhou1，CAO Jing1，GAO Ruiqi1
（1．Chinese Medical College，Chongqing Medical Universiity，Chongqing 400016，China；2．The First Clinical College，Chongqing Medical Universiity，Chongqing 400016，China；）

Objective To investigate the effect of electroacupunctrue and alimentary controlon strengthening mechanism of insulin sensitivity on the content of InsR and P90rskprotein in insulin resistance rat．Methods Seventy SD rats were randomly divided into common diet group（n＝10）and high－fat and high－carbohydrate diet group（n＝60）．Forty rats of insulin resistance in high－fat and high－carbohydrate diet group were chosen and divided into HFHCD 1 group，HFHCD 2 group，EA 1 group and EA 2 group（n＝10 each）．Electroacupunctrue was applied for 20 min once daily for 14 days．The changes of body weight，blood glucose and insulin were detected．The expression of InsR and P90rskprotein in insulin resistance rat was determined by real time fluorescence quantitative PCR．Results Expression of InsR and P90rskprotein：HFHCD was significantly lower than that of CD（P＜0．01），EA was significantly higher compared with HFHCD（P＜0．01），HFHCD2 was significantly higher compared with HFHCD1（P＜0．01），EA2 was significantly higher compared with EA1（P＜0．01）．Conclusion Electroacupunctrue and alimentary control can increase the expression of InsR and P90rskprotein，and increased glycogen synthesis，and restore insulin sensitivity，and improvement of insulin resistance．

electroacupunctrue；alimentary control；insulin resistance；InsR；P90rsk

R245.3

A

2095－6258（2015）04－0676－04

2015－02－28）

國家自然科學(xué)基金“按摩改善受損肌肉組織微循環(huán)重構(gòu)及有氧代謝相關(guān)酶活性變化促進(jìn)急性肌肉損傷臨床康復(fù)機(jī)理研究”（81273870）。

唐念珍（1989－），女 ，碩士研究生 ，主要從事針灸減肥研究。

*通信作者：唐成林，男，教授，電話－13452083746，電子信箱－CYTCL996＠163．com

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．04．006