生物信息學(xué)在預(yù)測(cè)和鑒定變形鏈球菌非編碼RNA 中的應(yīng)用*

夏 麗 王成龍 儲(chǔ)冰峰

變形鏈球菌是革蘭氏陽(yáng)性的兼性厭氧菌，是口腔主要的致齲細(xì)菌之一。變形鏈球菌主要的毒力是利用食物中的葡萄糖產(chǎn)酸，利用蔗糖合成胞外多糖進(jìn)行粘附[1]。

細(xì)菌非編碼RNA(small non-coding RNA，sRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度在50-500 個(gè)核苷酸，不能編碼蛋白質(zhì)的RNA。sRNA 有諸多功能，在細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA 的加工與修飾、mRNA 的穩(wěn)定性與翻譯、以及蛋白質(zhì)的降解、質(zhì)粒的復(fù)制、細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)和毒力等[2，3]方面發(fā)揮重要作用。生物信息學(xué)是根據(jù)sRNA 的特點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算機(jī)系統(tǒng)預(yù)測(cè)，使sRNA 不再是偶然被發(fā)現(xiàn)[4-7]。sRNA 的特點(diǎn)包括：比較基因組學(xué)的特點(diǎn)，其序列位于基因間區(qū)，在相近菌種間具有序列同源性；熱動(dòng)力學(xué)中保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)；特定的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，包括有σ70啟動(dòng)子，可預(yù)測(cè)的內(nèi)在終止子。

隨著對(duì)基因組研究的深入，Dragana 等[4]獲得了變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株UA159 的基因組序列，對(duì)變形鏈球菌的環(huán)境適應(yīng)及毒力相關(guān)基因有大量研究，但是調(diào)控機(jī)制并不清楚。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)變形鏈球菌UA159 的sRNA，對(duì)部分可能存在的序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)初步篩選，生物信息學(xué)鑒定。

1. 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè) 各種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法不同，預(yù)測(cè)結(jié)果變化較大。下面介紹本實(shí)驗(yàn)使用的4 種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法。

1.1.1 sRNAPredict sRNAPredict 是第一個(gè)使用轉(zhuǎn)錄信號(hào)的位置特點(diǎn)預(yù)測(cè)sRNA 序列的軟件[5]，特點(diǎn)包括：?jiǎn)?dòng)子信號(hào)，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，由TRANSTERMHP 預(yù)測(cè)的ρ-非依賴(lài)性終止子[6]，通過(guò)BLAST(Basic Local Alignment Search Tools)進(jìn)行同源性分析。這一方法可以用于預(yù)測(cè)不知道啟動(dòng)子序列的新sRNA。

1.1.2 SIPHT SIPHT 是進(jìn)行sRNA 大規(guī)模預(yù)測(cè)的生物信息學(xué)方法。該方法運(yùn)用高通量技術(shù)(high-throughput technology，SIPHT)，采用自動(dòng)工作流程，首先從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心

(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得所有細(xì)菌的復(fù)制子，進(jìn)而預(yù)測(cè)sRNA 的編碼基因，由Condor DAGMan’s高通量計(jì)算系統(tǒng)進(jìn)行運(yùn)算。

1.1.3 sRNASVM sRNASVM 是根據(jù)大腸桿菌sRNA 特點(diǎn)，基于機(jī)器學(xué)習(xí)方法編程，進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的方法。利用已知的細(xì)菌sRNA基因構(gòu)建訓(xùn)練集，提取描述訓(xùn)練集中每個(gè)樣本的特征向量，采用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法構(gòu)建sRNA 預(yù)測(cè)模型，預(yù)測(cè)出細(xì)菌特有的sRNA。

1.1.4 網(wǎng)站Oral pathogens non-coding small RNA prediction 名為Oral pathogens noncoding small RNA prediction 的網(wǎng)站針對(duì)口腔細(xì)菌進(jìn)行sRNA 預(yù)測(cè)。

1.2 RT-PCR 初步檢測(cè)

1.2.1 菌株 變形鏈球菌UA159 標(biāo)準(zhǔn)菌株為本室保存。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)菌總RNA 的提?。喝捬醮蠦HI 培養(yǎng)的變形鏈球菌菌液2ml，離心收集細(xì)菌，用0.1%DEPC 水洗滌一次。將細(xì)菌重懸于100μl 含5g/ L溶菌酶的TE(pH=8.0)緩沖液中，置于冰上15-20min。細(xì)胞溶液中加入20μl 10%SDS，置于沸水1min。于冰上冷卻并加入100μl Trizol 吹打混勻，加入20μl 氯仿，劇烈震搖15s。室溫靜置3-5min 后，于4℃，12000rpm 離心15min。吸取上層液相，移至新管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，置于-70℃沉淀過(guò)夜。4℃微量離心機(jī)，12000rpm 離心20min，可見(jiàn)RNA 在管底形成白色沉淀；吸棄上清，加入1ml 80%乙醇，顛倒混勻，于4℃，7500rpm 離心5min；棄上清，于室溫晾干沉淀，用42μl DEPC 水溶解RNA；-70℃保存。

RT-PCR 檢測(cè)：取2.5μg 所提總RNA 進(jìn)行加尾，加入5×M-MLV Buffer 5μl，100mM ATP 0.25μl，RNA2.5μg，PAP0.25μl，RNA 酶抑制劑0.5μl，DEPC 水補(bǔ)至21μl，37℃水浴1h。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄通用引物RT-Primer：

5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，將加尾產(chǎn)物中加入dNTP (2.5mM)2.5μl，M-MLV0.5μl，RT-Primer(500ng/ μl)1μl，42℃水浴1.5h，保存于-20℃。PCR 檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的sRNA，引物為sms1f：AATCAGCCTTTAGCTTTGATAC，sms2f：CTAAGACAGCAGGGGAGCGT，sms3f：TTTCTCCTCTCGTCTATT，sms4f：TGAATACGCCTACGACTCTGTG， sms5f： TATTCCTTTAACACTGTCC，QmiR-reverse：GCGAGCACAGAATTAATACGAC；反應(yīng)條件：95℃10min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃10min。熒光定量PCR反應(yīng)條件： 95℃10min； 95℃30s，54℃30s，72℃30s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)；95℃60s，54℃30s，95℃30s，采集熔解曲線(xiàn)。

1.3 sRNA 序列的家族鑒定 Rfam 數(shù)據(jù)庫(kù)是用序列比對(duì)和協(xié)方差統(tǒng)計(jì)的方法對(duì)非編碼RNA進(jìn)行家族分類(lèi)[18]。進(jìn)入Rfam 網(wǎng)站http:/ / rfam.xfam.org/ ，輸入sRNA 序列，系統(tǒng)自動(dòng)分析[19]，網(wǎng)頁(yè)跳轉(zhuǎn)至分析結(jié)果頁(yè)面。

2. 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)sRNAPredict，SIPHT，sRNASVM，網(wǎng)站Oral pathogens non-coding small RNA prediction 4 種方法預(yù)測(cè)變形鏈球菌UA159 的非編碼RNA。sRNAPredict 預(yù)測(cè)得到14 條序列，SIPHT 預(yù)測(cè)得到226 條序列，sRNASVM 預(yù)測(cè)得到132 條序列，網(wǎng)站 Oral pathogens non-coding small RNA prediction 預(yù)測(cè)得到37 條序列。其中SIPHT，sRNA Predict 和sRNASVM 三種方法預(yù)測(cè)得到4條相同序列；SIPHT，sRNASVM 和網(wǎng)站三種方法預(yù)測(cè)得到1 條相同序列；SIPHT 和sRNA Predict 兩種方法預(yù)測(cè)得到10 條相同序列；sRNASVM 和網(wǎng)站兩種方法預(yù)測(cè)得到9 條相同序列；SIPHT 和網(wǎng)站兩種方法預(yù)測(cè)得到6 條相同序列；SIPHT 和sRNASVM 兩種方法預(yù)測(cè)得到10條相同序列。4 種生物信息學(xué)方法共得到334 條不同sRNA 序列，有40 條序列是至少兩種生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到。

2.2 RT-PCR 檢測(cè)部分預(yù)測(cè)的sRNA 通過(guò)不同生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的sRNA 中，有40 條序列是至少兩種生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到。采用RT-PCR 檢測(cè)這40 條sRNA 序列，其中5 條存在RT-PCR 產(chǎn)物(圖1)。

圖1 RT-PCR 檢測(cè)出的5 條sRNA 電泳圖注：從左到右分別為pUC18 Marker，sms1，sms2，sms3，sms4，sms5。

2.3 sRNA 序列的家族鑒定 通過(guò)Rfam 網(wǎng)站分析5 條RT-PCR 檢測(cè)得到的sRNA 序列(表1)。sms2 序列屬于L10-Leader 家族(RF00557)，sms5序列屬于PyrR家族(RF00515)。 sms1，sms3，sms4 未檢測(cè)到相近的家族序列，可能為新發(fā)現(xiàn)的sRNA。

表1 經(jīng)RT-PCR檢測(cè)得到的5 條sRNA 序列

3. 討論

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法是常用的系統(tǒng)性尋找sRNA 的方法之一。最初的sRNA 是在實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)的，隨著發(fā)現(xiàn)的增加，對(duì)已發(fā)現(xiàn)的sRNA基因特點(diǎn)加以總結(jié)和推算，發(fā)展出各種生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)sRNA。目前主要由以下四個(gè)方面進(jìn)行預(yù)測(cè)[7]：一是比較基因組學(xué)，二是二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，三是轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測(cè)，四是機(jī)器學(xué)習(xí)方法。本研究通過(guò)4 種方法得到了變形鏈球菌sRNA 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果。其中sRNAPredict，SIPHT 和網(wǎng)站

Oral pathogens non-coding small RNA prediction

都屬于轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測(cè)的方法，sRNASVM 則是機(jī)器學(xué)習(xí)的模擬方法。轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測(cè)方法的基本假設(shè)是sRNA 基因在相近物種的基因組中具有一定的序列保守性和結(jié)構(gòu)保守性，有已知的啟動(dòng)子和終止子單元。雖然是同樣的原理，但編寫(xiě)軟件的方法不同，對(duì)參數(shù)的設(shè)定不同，會(huì)造成預(yù)測(cè)結(jié)果存在差別，所以在研究中雖然采用了3 種轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測(cè)的方法，其重復(fù)的序列并不多?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)的方法進(jìn)行的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)是采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建sRNA 預(yù)測(cè)模型，對(duì)基因組中新的sRNA 進(jìn)行預(yù)測(cè)。但這種方法需要對(duì)DNA 片段進(jìn)行窗口化處理，而sRNA 的序列長(zhǎng)度變化較大，很難選擇最佳的窗口大小[8]，使得機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建的sRNA預(yù)測(cè)模型的陽(yáng)性檢出率(positive prediction value，PPV)不是很高[9]?？偟恼f(shuō)來(lái)，生物信息學(xué)方法是根據(jù)已知的sRNA 序列特點(diǎn)，對(duì)基因組信息完整的細(xì)菌，通過(guò)不同的運(yùn)算方法來(lái)預(yù)測(cè)，可以獲得大量的sRNA 信息，但這些序列還是需要實(shí)驗(yàn)學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證。在本研究中，用4 種生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)其中40 條序列進(jìn)行RT-PCR 初步檢測(cè)，得到5 條序列，其中3 條來(lái)自sRNASVM 和網(wǎng)站兩種方法預(yù)測(cè)得到的相同序列，2 條來(lái)自SIPHT 和網(wǎng)站兩種方法預(yù)測(cè)得到的相同序列。

目前也有研究采用基因芯片對(duì)sRNA 進(jìn)行全面檢測(cè)，基因芯片可以獲得所有轉(zhuǎn)錄的RNA 序列，再通過(guò)大量的數(shù)據(jù)分析，得到sRNA 序列。但是一些sRNA 只在特定的環(huán)境中表達(dá)，對(duì)于這一部分sRNA 就很難檢測(cè)到。在對(duì)化膿性鏈球菌sRNA 的研究中[10]，同時(shí)采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和基因芯片進(jìn)行研究，總共預(yù)測(cè)出了75 條sRNA，其中只有7 條是兩種方法都檢測(cè)到的。

生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)和基因芯片檢測(cè)sRNA，都是對(duì)全基因組進(jìn)行sRNA 篩選，二者各有側(cè)重。生物信息學(xué)方法更加方便快捷，省時(shí)省力，只需要提供細(xì)菌的基因組信息就可以完成，與sRNA 是否在特殊環(huán)境表達(dá)無(wú)關(guān)；基因芯片則需要提供細(xì)菌的RNA，受實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)的限制，與sRNA 是否在特殊環(huán)境下表達(dá)密切相關(guān)，但檢測(cè)得到的序列真實(shí)性更高。不管是基因芯片，還是生物信息學(xué)方法，都需要進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4. 結(jié)論

生物信息學(xué)在變形鏈球菌sRNA 的研究中發(fā)揮了重要作用，預(yù)測(cè)了大量可能存在的序列，對(duì)相關(guān)序列進(jìn)行分析鑒定，與實(shí)驗(yàn)相輔相成，相互驗(yàn)證。目前生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果還不夠全面準(zhǔn)確，隨著實(shí)驗(yàn)的不斷深入，生物信息學(xué)也會(huì)快速發(fā)展，為研究提供更多可靠的結(jié)果。

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