• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬傳染性胃腸炎病毒HN-2012分離株M基因遺傳變異分析及其真核表達(dá)研究

    2015-06-27 10:17:35陳雅君曹貝貝徐衛(wèi)松程慧芳
    關(guān)鍵詞:胃腸炎毒株傳染性

    陳雅君, 曹貝貝, 徐衛(wèi)松, 程慧芳, 胡 慧

    (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省動物性食品安全重點(diǎn)試驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

    ?

    豬傳染性胃腸炎病毒HN-2012分離株M基因遺傳變異分析及其真核表達(dá)研究

    陳雅君1,2, 曹貝貝1, 徐衛(wèi)松1,2, 程慧芳1, 胡 慧1,2

    (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省動物性食品安全重點(diǎn)試驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

    以豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)HN-2012株的M基因?yàn)槟0?,設(shè)計了1對特異性引物,擴(kuò)增了M基因,經(jīng)克隆測序后,將該基因序列與NCBI中TGEV毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行遺傳變異分析。將M基因亞克隆至真核表達(dá)載體pCAGGS-M-flag中,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,利用flag標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot檢測分析。結(jié)果表明,TGEV HN-2012株的M基因與其他毒株間核苷酸的同源性分別為94.8%~99.0%,與中國其他毒株關(guān)系較遠(yuǎn)。Western blot結(jié)果可見大小約為29.5 kD的目的條帶,表明M基因成功的在293T細(xì)胞中表達(dá)。

    TGEV 河南分離株(HN-2012);M基因;293T細(xì)胞;真核表達(dá)

    豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)引起的以嘔吐、水樣腹瀉為主要臨床特征的高度接觸性腸道傳染病[1,2]。該病對2周齡以內(nèi)的仔豬致死率高達(dá)100%,不同年齡和品種的豬均易感染此病。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)為冠狀病毒,其基因組結(jié)構(gòu)包括膜蛋白(M)、小膜蛋白(sM) 、纖突蛋白(S)以及核蛋白(N)等基因。其中,M基因全長2.5×103bp,編碼初級翻譯產(chǎn)物為262個氨基酸殘基的轉(zhuǎn)膜蛋白,切掉信號肽之后轉(zhuǎn)膜為成熟M蛋白,其相對分子量約為29 kD。M蛋白在病毒囊膜中歷經(jīng)多次跨膜[6]。M蛋白不僅決定了冠狀病毒的裝配位點(diǎn),還能介導(dǎo)IFN-a和補(bǔ)體依賴性中和抗體的產(chǎn)生。感染TGEV后仔豬的血液和腸道中的高水平的IFN也證實(shí)TGEV M蛋白與PBL細(xì)胞膜之間的相互作用會誘導(dǎo)IFN-a產(chǎn)生[6]。本試驗(yàn)對TGEV河南新分離株(HN-2012)的M基因進(jìn)行克隆及序列分析,并將M基因克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS中,在293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達(dá),為研究清楚M蛋白分子的結(jié)構(gòu)、功能以及篩選分子診斷試劑及研制新型核酸疫苗提供科學(xué)基礎(chǔ),也為研究TGEV在河南以及在中國的遺傳變異、分子流行病學(xué)等奠定了理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病毒細(xì)胞 TGEV HN-2012株由河南省動物性食品安全重點(diǎn)試驗(yàn)室分離并保存;改造的真核表達(dá)載體pCAGGS和真核細(xì)胞293T由中國科學(xué)院武漢病毒研究所王漢中研究員饋贈;大腸桿菌DH5a由本試驗(yàn)保存提供。

    1.1.2 主要試劑與儀器 Trans 5K DNA Marker、Trans 15K DNA Marker夠自南京百斯凱科技有限公司;DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司;KOD Neo DNA聚合酶購自TOYOBO公司;限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BglⅡ均購自大連寶生物工程有限公司;T4 DNA連接酶和磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒均購自Promega公司;胎牛血清、DMEM購自Gibco公司;蛋白分子量marker為Fermentas公司產(chǎn)品;Western blot用的HRP標(biāo)記的二抗和顯色系統(tǒng)購自Pierce公司。

    1.2 PCR引物設(shè)計與合成

    根據(jù)GenBank公布的TGEV M基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對引物。引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列及擴(kuò)增長度見表1。

    表1 引物序列及預(yù)計擴(kuò)增長度

    注:上游引物插入XhoⅠ酶切位點(diǎn),下游引物插入BglⅡ酶切位點(diǎn)和flag標(biāo)簽序列。

    Note: Forward primer includes XhoI restriction site, and reverse primer includes Bgl Ⅱ restriction site and flag-lable sequence.

    1.3 TGEVM基因的PCR擴(kuò)增及克隆

    PCR反應(yīng)總體系為25 μL,其中模版2 μL,上、下游引物各0.5 μL,KOD Neo DNA聚合酶0.5 μL,dNTPs 2 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,MgSO41 μL,滅菌ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,退火溫度51.4℃,68 ℃1 min,35個循環(huán);最后68 ℃延伸5 min。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,回收目的片段,克隆到pGEM-T easy vector,進(jìn)行PCR鑒定。

    1.4 序列測定及分析

    將經(jīng)PCR鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將所得基因序列與GenBank中登錄的不同毒株的TGEV M蛋白基因序列,及由其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析比較。所選序列見表2。

    1.5M基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

    利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BglⅡ分別對pGEM-Teasy-M-flag和pCAGGS載體進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后,切取酶切產(chǎn)物,用膠回收純化試劑盒分別回收目的片段,再用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中,涂含Amp的LB平板培養(yǎng)過夜,挑取單個菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后,提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCAGGS-M-flag。

    1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

    表2 從NCBI中所選TGEV 基因登錄號

    用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 d將293T細(xì)胞接種到小的細(xì)胞培養(yǎng)皿(35 mm), 轉(zhuǎn)染前密度達(dá)到80 %左右;接種細(xì)胞18~20 h后可用于轉(zhuǎn)染。具體步驟為:①取出小皿培養(yǎng)的細(xì)胞,更換新鮮的含10 %血清的DMEM培養(yǎng)液;②取2個無菌的EP管,標(biāo)記為A1和B1。先向A1管內(nèi)依次加入對應(yīng)體積的ddH2O、pCAGGS-M-flag質(zhì)粒、CaCl2,輕輕混勻(終體積為100 μL);B1管內(nèi)加入100 μL的2×HBS溶液;③將管A和管B溶液混合:即將管A內(nèi)混合液慢慢滴加至管B中,一邊滴加管A液體一邊輕彈管B溶液;④混合好后室溫靜置30 min;⑤將室溫靜置了30 min的混合液(A+B)用移液器輕輕混勻后滴加到小皿內(nèi),放置37 ℃ ,5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng);⑥轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮的培養(yǎng)液。同時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCAGGS作為陰性對照。

    1.7 Western blot鑒定M基因的表達(dá)情況

    收集轉(zhuǎn)染后24 h的293T細(xì)胞,先用PBS洗1~2次,向細(xì)胞中加入100 μL的RIPA細(xì)胞裂解液,冰上裂解10 min;12 000 r·min-14 ℃離心5 min;取上清液,加入 25 μL的5倍上樣Buffer,沸水中煮 10 min,12 000 r·min-14 ℃離心10 min,取上清液,進(jìn)行SDS-PAGE電泳。利用半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將膜放入5% BSA中4 ℃封閉過夜;TBST洗滌3次,每次5 min;加入flag標(biāo)簽抗體 4 ℃過夜或37 ℃ 1 h;TBST洗膜3次,每次5 min;加入1∶10 000稀釋的羊抗鼠IgG(HRP標(biāo)記),37 ℃孵育1 h;TBST洗膜3次,每次5 min;進(jìn)行HRP顯色。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TGEVM基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

    以TGEV HN-2012株的cDNA為模板,加入上、下游引物,PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。在789 bp處獲得了一特異性條帶,與預(yù)期大小相符。

    M: Trans 5K DNA Marker;1:TGEV HN-2012 M PCR擴(kuò)增結(jié)果,2:空白對照。

    M: Trans 5K DNA Marker; 1: TGEV HN-2012 M gene of PCR amplification.2: Negative control.

    圖1 TGEV HN-2012M的PCR擴(kuò)增

    Fig.1 TGEV HN-2012Mgene of PCR amplification

    2.2 HN-2012株TGEVM基因的遺傳變異分析

    將PCR擴(kuò)增得到的M基因全長克隆、測序后,運(yùn)用生物信息學(xué)軟件MegAlign對所測得的基因序列進(jìn)行遺傳變異分析。結(jié)果顯示,TGEV HN-2012株M基因與其它毒株的核苷酸序列同源性為94.8%~99%,與attenuated H株(EU074218.2,China)和H16(FJ755618.2,China)同源性最高,為99.0%。遺傳進(jìn)化分析顯示HN-2012株的M基因和其它毒株在1個群,而FJ株在另1個群,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HN-2012毒株獨(dú)立的分出1個亞群,而同一群的其它毒株在另1個亞群(圖2)。

    2.3 重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag的構(gòu)建

    分別用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BglⅡ?qū)GEM-Teasy-M-flag進(jìn)行雙酶切,純化后進(jìn)行連接,構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-M-flag。對該重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,目的片段的大小與預(yù)期一致,結(jié)果見圖3。

    2.4 Western blot分析pCAGGS-M-flag在293T細(xì)胞中的表達(dá)

    Western blot檢測結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag的293T細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)有針對flag的標(biāo)簽抗體的特異性條帶為29.5 kD;而在轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的293T細(xì)胞中,在這個位置未檢測到相應(yīng)的目的條帶,說明重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可成功表達(dá)蛋白(圖4)。

    圖2 TGEV HN-2012 M基因核苷酸進(jìn)化樹分析結(jié)果

    M: Trans 15k DNA Marker; 1: 重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag雙酶切; 2:陰性對照。

    M: Trans 15k DNA Marker; 1: Recombinant plasmid pCAGGS-M-flag degested by restriction enzyme; 2 Negative control.

    圖3 重組質(zhì)粒pCAGGS-M-flag雙酶切結(jié)果

    Fig.3 Recombinant plasmid pCAGGS-M-flag doubleenzyme cutting results

    M: 預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker;1: 轉(zhuǎn)染pCAGGS-M-flag的293T細(xì)胞; 2: 轉(zhuǎn)染的pCAGGS的293T細(xì)胞。

    M: Prestained protein Marker; 1: 293T cells transfected with pCAGGS-M-flag vector;2: 293T cells transfected with pCAGGS vector.

    圖4 M重組蛋白Western blot分析結(jié)果

    Fig.4 Western blot analysis of recombinant protein M

    3 結(jié)論與討論

    豬傳染性胃腸炎是一種嚴(yán)重危害仔豬健康的高度接觸傳染性腸道疾病。目前,調(diào)查研究顯示歐洲國家豬群血清TGEV陽性率可達(dá)100%。中國部分發(fā)病豬場仔豬的存活率可低至10%,因而該病的防制對世界養(yǎng)豬業(yè)至關(guān)重要。TGEV包括4種結(jié)構(gòu)蛋白,纖突糖蛋白(S)、 膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和小包膜糖蛋白(E)。M蛋白是一種跨膜蛋白,在病毒裝配、成熟和釋放中起著重要作用。本研究從實(shí)驗(yàn)室分離的TGEV HN-2012毒株中擴(kuò)增出全長M基因,和其它毒株的M基因進(jìn)行了遺傳變異分析,結(jié)果顯示TGEV HN-2012的M基因與其他毒株間核苷酸的同源性在94.8%以上,證實(shí)M基因具有較高的保守性。這為M基因作為TGEV分子生物學(xué)診斷侯選基因提供了理論依據(jù)。

    TGEVM基因編碼的M蛋白是一種N-端和C-端被糖基化的完整膜蛋白,其羧基端暴露于病毒粒子的表面,是病毒的免疫顯性區(qū),針對該區(qū)域的特異性抗體可以有效中和TGEV以及介導(dǎo)受細(xì)胞發(fā)生補(bǔ)體溶解反應(yīng)[7]。M蛋白主要包埋于病毒脂質(zhì)囊膜,主導(dǎo)了病毒顆粒的構(gòu)建[8,9],決定了病毒粒子的裝配位點(diǎn)、出芽位點(diǎn)以及病毒的成熟,同時介導(dǎo)IFN-a以及補(bǔ)體依賴性中和抗體的產(chǎn)生[10]。有報道表明IFN-a的產(chǎn)生依賴于M基因N末端的最后22個殘基[11,12]。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了含M基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,通過免疫印跡的方法證實(shí)M基因在293細(xì)胞中成功表達(dá)。TGEV M蛋白在體外成功表達(dá),可作為診斷抗原,亦可用其制備抗血清及單克隆抗體,進(jìn)行疾病的快速診斷,也為豬傳染性胃腸炎新型核酸疫苗的研制奠定了理論基礎(chǔ)。

    [1] 鄒 昊. 豬傳染性胃腸炎病毒膜蛋白親和多肽的篩選與鑒定[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

    [2] 冷 勇. 豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及結(jié)構(gòu)基因重組桿狀病毒的構(gòu)建[D]. 重慶:西南大學(xué), 2013.

    [3] ZHAO S, GAO Q, QIN T, et al. Effects of virulent and attenuated transmissible gastroenteritis virus on the ability of porcine dendritic cells to sample and present antigen[J]. Veterinary microbiology, 2014, 171(1): 74-86.

    [4] 孫雪嬌. 豬傳染性胃腸炎病毒膜蛋白單克隆抗體的制備與抗原表位的鑒定[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

    [5] PATON D, IBATA G, SANDS J, et al. Detection of transmissible gastroenteritis virus by RT-PCR and differentiation from porcine respiratory coronavirus [J]. Journal of virological methods, 1997, 66(2): 303-9.

    [6] 吳 凌, 李一經(jīng), 武心鎮(zhèn). 豬傳染性胃腸炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表達(dá)[J]. 中國獸醫(yī)科技, 2005, 35 (11): 869-874.

    [7] 任曉峰, 鄒昊, 孫雪嬌. 豬傳染性胃腸炎病毒M蛋白的表達(dá)與抗體制備[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 45(4): 83-87.

    [8] 冷 勇, 宋振輝, 卿家超, 等. 豬傳染性胃腸炎病毒 M, sM 基因重組桿狀病毒的構(gòu)建及病毒樣顆粒的組裝[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2013, 44(9): 1432-1437.

    [9] UMPERMAN J,LOCKER J K,MEIJER A,et a1.Coronavirus M proteins accumulate in the Golgi complex beyond the site of virion budding[J].J Virol,1994,68(10):6523-6534.

    [10]NARAYANAN K, MAEDA A, MAEDA J, et al. Characterization of the coronavirus M protein and nucleocapsid interaction in infected cells[J].J Virol,2000,74:8127-8134.

    [11]RIFFAULT S, GROSCLAUDE J, VAYSSIER M, et al. Recoustitued coronavirus TGEV virosomes lose the virus ability to induce porcine interferon-alpha production[J]. Vet Res,1997,28(2):105-114.

    [12]朱曉琳, 王 劭, 陳少鶯, 等. 豬傳染性胃腸炎病毒福建株犕基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2011, 26(5): 925-929.

    (責(zé)任編輯:蔣國良)

    Genetic variation analysis and eukaryotic expression ofMgene of porcine transmissible gastroenteritis virus of HN-2012 strain

    CHEN Yajun1,2, CAO Beibei1, XU Weisong1,2, CHENG Huifang1, HU Hui1,2

    (1.Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Zoonotic Food Safety Key Laboratory of Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

    A pair of primers were designed according to theMgene of porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) HN-2012 strain, theMgene was amplificated, cloned and sequenced. The sequencedMgene was compared with the otherMgene sequences of TGEV obtained in NCBI, and phylogenetic tree was constructed to analyze the genetic variation. Then the M gene was cloned into the eukaryotic expression vector pCAGGS-M-flag. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells, and tested by western blot using the flag tag antibody. The results showed that the necleotide similarity betweenMgenes of the TGEV HN-2012 strain and other strains was from 94.8% to 99.0%, showing HN-2012 strain differed from all other TGEV isolates, and formed a new separate group. Western blot result showed the M protein was expressed successfully in 293T cells with a 29.5 kD protein.

    TGEV HN-2012 strain;Mgene; 293T cells; erkaryotic expression

    2015-01-19

    國家自然科學(xué)基金項目(31101796);河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(112300410161)

    陳雅君(1985-),女,河南焦作人,碩士研究生,從事動物病原學(xué)方面的研究。

    胡 慧(1976-),女,陜西西鄉(xiāng)人,副教授,博士。

    1000-2340(2015)04-0472-04

    S852.659

    A

    猜你喜歡
    胃腸炎毒株傳染性
    中西醫(yī)結(jié)合治療豬傳染性胃腸炎
    豬傳染性胃腸炎的治療
    法國發(fā)現(xiàn)新冠新變異毒株IHU
    豬傳染性胃腸炎的防治
    豬傳染性胃腸炎的防治
    廣西鴨圓環(huán)病毒流行毒株遺傳變異分析
    牛傳染性鼻氣管炎IBRV/JZ06-3基礎(chǔ)毒株毒力返強(qiáng)試驗(yàn)
    豬瘟強(qiáng)毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測
    雞傳染性喉氣管炎的診治
    久久久久九九精品影院| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜两性在线视频| 久久亚洲精品不卡| 两个人视频免费观看高清| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产av一区在线观看免费| 免费看光身美女| 国产爱豆传媒在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲国产精品成人综合色| 国产成人aa在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 我要搜黄色片| xxxwww97欧美| 国产精品亚洲美女久久久| 国产乱人视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| av女优亚洲男人天堂| 国产精品 欧美亚洲| 日韩国内少妇激情av| 午夜福利在线在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产在视频线在精品| 在线国产一区二区在线| 成人精品一区二区免费| 激情在线观看视频在线高清| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美成人a在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 搡老岳熟女国产| 听说在线观看完整版免费高清| 国产真实乱freesex| 亚洲人成网站高清观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99热只有精品国产| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 激情在线观看视频在线高清| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美在线一区亚洲| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品福利观看| 一区福利在线观看| 一区二区三区免费毛片| 中出人妻视频一区二区| 一级毛片女人18水好多| 国内精品美女久久久久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费电影在线观看免费观看| 午夜精品在线福利| 99热这里只有精品一区| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲黑人精品在线| 久久久久国内视频| 久久久国产成人免费| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产日本99.免费观看| 中出人妻视频一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品久久久久久久久久久久久| 国产综合懂色| 人人妻人人看人人澡| www日本在线高清视频| 老司机在亚洲福利影院| 欧美区成人在线视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 88av欧美| 国产中年淑女户外野战色| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 天美传媒精品一区二区| 狂野欧美激情性xxxx| 无限看片的www在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产成人系列免费观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产精品久久久久久久久免 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 有码 亚洲区| 操出白浆在线播放| 欧美+日韩+精品| av天堂在线播放| 乱人视频在线观看| 人妻久久中文字幕网| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久久久久久大av| 免费观看的影片在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| aaaaa片日本免费| 国产熟女xx| 亚洲乱码一区二区免费版| 天美传媒精品一区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久人人人人人| 91在线精品国自产拍蜜月 | 精品乱码久久久久久99久播| 午夜精品在线福利| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 亚洲国产欧美网| 日本五十路高清| 偷拍熟女少妇极品色| 国产成人欧美在线观看| 在线天堂最新版资源| 长腿黑丝高跟| 最新在线观看一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 日本 av在线| 18美女黄网站色大片免费观看| 99久久成人亚洲精品观看| 熟女电影av网| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲不卡免费看| 熟女电影av网| 国产一区二区在线av高清观看| 无人区码免费观看不卡| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲18禁久久av| 女警被强在线播放| 国语自产精品视频在线第100页| 宅男免费午夜| 色视频www国产| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲片人在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 内射极品少妇av片p| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产免费男女视频| 最后的刺客免费高清国语| 欧美成人性av电影在线观看| 中国美女看黄片| 久久久久性生活片| 国产久久久一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产探花在线观看一区二区| 老司机在亚洲福利影院| 丁香欧美五月| 亚洲无线在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 色av中文字幕| 亚洲成av人片在线播放无| 日韩欧美 国产精品| 久久亚洲精品不卡| 国产麻豆成人av免费视频| 搡老熟女国产l中国老女人| av国产免费在线观看| 99riav亚洲国产免费| av专区在线播放| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产午夜精品论理片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 麻豆国产av国片精品| 亚洲一区二区三区不卡视频| 美女黄网站色视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 婷婷精品国产亚洲av| 男女床上黄色一级片免费看| 久久草成人影院| 波野结衣二区三区在线 | 麻豆成人午夜福利视频| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品日韩av在线免费观看| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲成人久久性| 极品教师在线免费播放| 真实男女啪啪啪动态图| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成人av在线播放网站| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品久久久人人做人人爽| 99在线视频只有这里精品首页| 一本综合久久免费| 国产精品免费一区二区三区在线| 日本黄色片子视频| 不卡一级毛片| 欧美激情在线99| 免费观看精品视频网站| 午夜a级毛片| 久久九九热精品免费| 国产熟女xx| 欧美午夜高清在线| 欧美中文日本在线观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 天美传媒精品一区二区| a级一级毛片免费在线观看| 搡老岳熟女国产| 午夜精品在线福利| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产黄a三级三级三级人| www国产在线视频色| 午夜两性在线视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产精品一区二区免费欧美| 无遮挡黄片免费观看| 欧美一区二区亚洲| 国产真实乱freesex| 人人妻人人看人人澡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成年免费大片在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲在线自拍视频| 热99在线观看视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲精品在线美女| 中亚洲国语对白在线视频| 少妇的逼水好多| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美成人性av电影在线观看| 91在线观看av| 免费高清视频大片| 精品久久久久久久久久久久久| 午夜免费成人在线视频| 精品欧美国产一区二区三| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产v大片淫在线免费观看| 身体一侧抽搐| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲欧美日韩东京热| 有码 亚洲区| 日本三级黄在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成人影院久久av| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲真实伦在线观看| 日韩欧美精品免费久久 | 国产男靠女视频免费网站| 美女cb高潮喷水在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 欧美性感艳星| 国产激情偷乱视频一区二区| 97超视频在线观看视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产野战对白在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩精品网址| а√天堂www在线а√下载| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品国产美女av久久久久小说| 很黄的视频免费| 成年女人看的毛片在线观看| 久久亚洲真实| 国产精品亚洲美女久久久| АⅤ资源中文在线天堂| 99热这里只有是精品50| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 91麻豆av在线| 午夜免费成人在线视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久国产精品影院| 欧美黑人巨大hd| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久人妻av系列| 91av网一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美在线一区亚洲| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产综合懂色| 少妇丰满av| xxxwww97欧美| 午夜福利在线在线| 热99re8久久精品国产| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 99riav亚洲国产免费| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品久久电影中文字幕| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 18禁美女被吸乳视频| 色综合婷婷激情| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品久久久久久成人av| 久久精品国产自在天天线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产欧美人成| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲,欧美精品.| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产亚洲欧美98| 又粗又爽又猛毛片免费看| 美女cb高潮喷水在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 啪啪无遮挡十八禁网站| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 舔av片在线| 国产探花在线观看一区二区| 少妇的逼好多水| 国产在视频线在精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产成人啪精品午夜网站| 无遮挡黄片免费观看| 很黄的视频免费| 91久久精品电影网| 欧美色视频一区免费| 欧美日韩综合久久久久久 | av欧美777| www国产在线视频色| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 1000部很黄的大片| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品亚洲一级av第二区| 中国美女看黄片| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精华国产精华精| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日本免费a在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 乱人视频在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美日韩乱码在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 内射极品少妇av片p| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成av人片在线播放无| 丰满乱子伦码专区| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲乱码一区二区免费版| 成年人黄色毛片网站| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲av第一区精品v没综合| 无限看片的www在线观看| 极品教师在线免费播放| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产av麻豆久久久久久久| 国产黄a三级三级三级人| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 男人和女人高潮做爰伦理| 99视频精品全部免费 在线| 日本 欧美在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费搜索国产男女视频| 在线a可以看的网站| 亚洲国产精品成人综合色| 成人国产综合亚洲| 久久精品91无色码中文字幕| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 美女 人体艺术 gogo| 91久久精品电影网| 国产中年淑女户外野战色| 97碰自拍视频| 欧美3d第一页| 国产不卡一卡二| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 精品久久久久久成人av| 亚洲激情在线av| 黄色丝袜av网址大全| 他把我摸到了高潮在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 一进一出好大好爽视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 免费电影在线观看免费观看| 怎么达到女性高潮| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 少妇的逼水好多| 中文字幕熟女人妻在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 69人妻影院| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲av二区三区四区| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产真实乱freesex| 日本免费一区二区三区高清不卡| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看一区二区三区| 欧美大码av| 亚洲18禁久久av| 窝窝影院91人妻| 久久久国产精品麻豆| 91在线观看av| 亚洲av熟女| 黄色成人免费大全| 免费观看的影片在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 1024手机看黄色片| 午夜福利在线在线| 99久国产av精品| avwww免费| av黄色大香蕉| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日本a在线网址| 亚洲欧美日韩东京热| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品不卡国产一区二区三区| 一本一本综合久久| 波多野结衣高清无吗| 久久久久性生活片| 国产不卡一卡二| 99久久成人亚洲精品观看| 久久中文看片网| 亚洲av成人精品一区久久| 国产黄a三级三级三级人| 午夜日韩欧美国产| 男女之事视频高清在线观看| 久久国产精品影院| 一级作爱视频免费观看| 午夜影院日韩av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99热只有精品国产| 国产欧美日韩精品一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 精品一区二区三区人妻视频| x7x7x7水蜜桃| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲男人的天堂狠狠| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产高清三级在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 韩国av一区二区三区四区| 欧美成人性av电影在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 少妇的逼好多水| 欧美日本视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 99视频精品全部免费 在线| 久9热在线精品视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲成a人片在线一区二区| 丁香欧美五月| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 免费无遮挡裸体视频| 嫁个100分男人电影在线观看| av在线蜜桃| 午夜激情福利司机影院| 一a级毛片在线观看| 国产高清videossex| 变态另类丝袜制服| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产又黄又爽又无遮挡在线| 有码 亚洲区| 欧美乱色亚洲激情| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久久九九精品二区国产| 国产麻豆成人av免费视频| 搡老岳熟女国产| 欧美大码av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 十八禁人妻一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产精品久久久久久精品电影| 天堂网av新在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国语自产精品视频在线第100页| 一本一本综合久久| 亚洲自拍偷在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产免费一级a男人的天堂| 美女高潮的动态| 免费av毛片视频| 麻豆一二三区av精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 美女cb高潮喷水在线观看| 91字幕亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲,欧美精品.| 9191精品国产免费久久| 天天躁日日操中文字幕| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久草成人影院| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美日本视频| 99riav亚洲国产免费| 97碰自拍视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品乱码一区二三区的特点| 桃红色精品国产亚洲av| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲第一电影网av| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲色图av天堂| 久久久色成人| www日本黄色视频网| 欧美一级a爱片免费观看看| 黄色视频,在线免费观看| 麻豆成人av在线观看| 99热6这里只有精品| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲av熟女| 亚洲成人久久性| 欧美成人免费av一区二区三区| www.999成人在线观看| 亚洲无线观看免费| 免费观看的影片在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 成人午夜高清在线视频| 国内精品美女久久久久久| 久久草成人影院| 精品国产三级普通话版| 国产综合懂色| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 岛国在线观看网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产一区二区在线观看日韩 | 免费电影在线观看免费观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产亚洲精品久久久com| 日韩欧美精品v在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美午夜高清在线| 久久久精品大字幕| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产69精品久久久久777片| 美女大奶头视频| 欧美3d第一页| av欧美777| 久久伊人香网站| 亚洲av美国av| 国产激情偷乱视频一区二区| 乱人视频在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久色成人| 又粗又爽又猛毛片免费看| av片东京热男人的天堂| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜福利成人在线免费观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 真实男女啪啪啪动态图| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日韩国内少妇激情av| 日本 欧美在线| 999久久久精品免费观看国产| 熟女人妻精品中文字幕| 日本与韩国留学比较| 亚洲欧美精品综合久久99| 他把我摸到了高潮在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久久久久午夜电影| 国产亚洲精品一区二区www| 久久久久九九精品影院| 亚洲成人中文字幕在线播放| a级一级毛片免费在线观看| 成人无遮挡网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品一区二区三区av网在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 波多野结衣高清无吗| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲 国产 在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲精品亚洲一区二区| 两个人看的免费小视频| 欧美激情在线99| av天堂在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产男靠女视频免费网站| 中文字幕久久专区| 一区二区三区免费毛片| 国产成人系列免费观看| 波多野结衣巨乳人妻| 国产亚洲精品久久久com| 国内揄拍国产精品人妻在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| av女优亚洲男人天堂| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲最大成人中文| 亚洲人成伊人成综合网2020| 波多野结衣高清作品|