高效液相色譜法在乳制品三聚氰胺含量檢測中的應(yīng)用淺析

朱曉晨（上海實(shí)力可商品檢驗(yàn)有限公司,上海200231）

高效液相色譜法在乳制品三聚氰胺含量檢測中的應(yīng)用淺析

朱曉晨
（上海實(shí)力可商品檢驗(yàn)有限公司,上海200231）

摘要：建立一個快速有效的樣品預(yù)處理方法，利用高效液相色譜儀，建立一個快速、有效、靈敏、準(zhǔn)確并具有非常良好的可重復(fù)性的高效液相檢測方法，檢測乳制品中的三聚氰胺的含量。方法：利用HPLC，在240nm的波長處，對乳制品中的三聚氰胺的含量進(jìn)行檢測。結(jié)果：高效液相色譜法檢測乳制品中三聚氰胺的含量的方法有很好的準(zhǔn)確度和精確度，而且該方法操作方便、快速。結(jié)論：為了保證乳制品的安全可食用，需要準(zhǔn)確而快速的對乳制品中的三聚氰胺含量進(jìn)行檢測。利用高效液相色譜法可以既準(zhǔn)確又快速的檢測出乳制品中三聚氰胺的含量，為乳制品的安全保駕護(hù)航。

關(guān)鍵詞：三聚氰胺；乳制品；高效液相色譜法

0引言

三聚氰胺(melamine)簡稱三胺，為白色晶體粉末。俗稱又為蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。在水中的溶解度很低，并且其水溶液呈弱堿性，不溶于C2H5OC2H5，C6H6和CCl4。能溶于甲醇、乙腈、乙酸、甲醛等有機(jī)溶劑。三聚氰胺能被各種酸酸化，生成三聚氰胺鹽。

在傳統(tǒng)食品工業(yè)上，通常采用凱氏定氮法測量蛋白質(zhì)含量，這種方法的缺陷是只能測出食品中氮的含量，不能測出氮的來源和種類。蛋白質(zhì)中氮的含量是16%，三聚氰胺中氮的含量是66%，因此三聚氰胺被一些不法商家利用，將其添加進(jìn)食品中，造成食品含有高蛋白的假象，在乳制品中尤是如此。三聚氰胺被人體吸收后，在人體中發(fā)生分解反應(yīng)，得到產(chǎn)物三聚氰酸，三聚氰胺和三聚氰酸結(jié)合形成網(wǎng)狀體，在人體中生成結(jié)石，對人體造成危害。

在2007年，美國發(fā)生了幾起貓、狗的不明中毒死亡事件，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根源是寵物食品中違規(guī)添加了三聚氰胺。2008年，我國發(fā)生了震驚國人的“毒奶粉”事件，其根本原因是不法商家在患兒使用的奶粉中添加了三聚氰胺。政府部門也在積極應(yīng)對三聚氰胺食品安全事件，全國的各個食品檢測機(jī)構(gòu)均努力研發(fā)各種行之有效的檢測方法，并出臺了各項(xiàng)檢測標(biāo)準(zhǔn)：GB/T22388-2008GB/T22400-2008GB/T22288-2008等。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1?主要儀器

2695/2487含有柱溫箱和紫外檢測器的高效液相色譜儀（美國Waters公司）；TTL-DCⅡ氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技有限公司）；HI850R高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；WIGGENSVortex3000漩渦混合器（北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所）；超聲提取儀（上海比朗儀器制造有限公司）；陽離子交換固相萃取柱（60mg/3mL）（北京華盛譜信儀器有限責(zé)任公司）。

1.1.2?主要試劑

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；甲醇（色譜級）；乙腈（色譜級）；超純水（色譜級）；氨水（濃度為25%~28%）；三氯乙酸（10g/L）；乙酸鉛溶液（22g/L）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1?提取液配制

量取480ml濃度為10g/L三氯乙酸溶液，向其中加入20ml濃度為22g/L的乙酸鉛溶液。

1.2.2?氨化甲醇溶液配制

取5ml氨水用甲醇定容至1L。

1.2.3?流動相的配制

稱量庚烷磺酸鈉2.02g，檸檬酸2.10g，與1L的容量瓶中，用超純水定容至1L。量取900ml該溶液與100ml乙腈混合。

1.2.4?標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制

量取200ml甲醇溶液，用超純水稀釋至1000ml，得到20%（v/v）溶液。稱取100mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100ml容量瓶中，用配制好的20%（v/v）溶液定容至100ml，終濃度為1mg/ml。儲存在4℃冰箱中，可有效保存3個月。

1.2.5?標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

量取適量三聚氰胺貯備液，以20%（v/v）的甲醇溶液將其稀釋為1.0、5.0、10、25、50μg/L，儲存在4℃冰箱中，可有效保存1周。1.2.6?樣品的預(yù)處理

將乳制品混勻，然后稱取2.00g于50ml離心管中，加入提取液稀釋至20.0ml，渦旋處理30s，超聲處理20min，然后靜止2min，在在10000rpm離心5min。

1.2.7?凈化

分別量取3ml甲醇和3ml超純水，對混合型離子交換固相萃取柱進(jìn)行活化。精確量取10.0ml離心上清液，然后分批上柱，將過柱流速穩(wěn)定在1ml/min。然后用3ml超純水洗滌滌混合型陽離子交換固相萃取柱，接著繼續(xù)用3ml甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱，將洗滌液吹干后，再取3ml氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，置于氮吹儀上，用50℃氮?dú)獯蹈?。用移液管?.0ml200ml/L甲醇溶液將殘留樣品溶解，渦旋1min，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，用高效液相色譜法進(jìn)行測定。

1.2.8色譜條件

色譜柱：C18柱，150*4.6mm，5μm，柱溫30℃，流速1.0ml/ min，進(jìn)樣量20μL。流動相：見方法。

1.2.9?檢測

以保留時間為準(zhǔn)進(jìn)行定性，試樣的保留時間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間要小于2%。定量測定采用單點(diǎn)或者多點(diǎn)外標(biāo)法。乳制品樣品中三聚氰胺的峰面積在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。

1.2.10?工作曲線以及三聚氰胺含量計算

C表示樣品中三聚氰胺的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，單位是毫克每千克（mg/kg），單點(diǎn)校正的公式：C=A*CS*V1*V3*1000/ AS*M*V2*1000；

式中：AS指的是液相色譜峰型的面積；A指的是樣品溶液對應(yīng)的色譜峰面積；CS指的是三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（μg/ml），V1和V2分別指的是提取液的體積和過柱體積，單位是mL，M是進(jìn)樣量，單位是g。

2結(jié)果

2.1凈化條件的確定

三聚氰胺是堿性物質(zhì)，因此在該實(shí)驗(yàn)中，使用OasisMCX固相萃取柱凈化，OasisMCX固相萃取柱能有效的留住堿性物質(zhì)，并能將乳制品樣品中的雜質(zhì)去除，本實(shí)驗(yàn)中，以低濃度的氨水為洗脫液，可以最大程度上降低萃取柱對堿性樣品中雜質(zhì)的吸附。盡可能消除雜質(zhì)對試驗(yàn)結(jié)果的干擾。將5ml氨水用甲醇溶解至100ml得到50ml/L的氨化甲醇溶液，當(dāng)三聚氰胺通過OasisMCX固相萃取柱后，用氨化甲醇溶液洗脫，三聚氰胺的回收率能達(dá)到99%。

2.2液相條件的確定

三聚氰胺屬于極性非常強(qiáng)的有機(jī)物，通過反相C18柱時，幾乎沒有保留，為了更好的進(jìn)行色譜分離，形成有效、清晰的色譜峰，以乙腈和的0.01moL/L庚烷磺酸鈉及檸檬酸離子緩沖液為流動相，調(diào)節(jié)兩者之間的比例進(jìn)行試驗(yàn)（1：9和6：94）以縮短分離時間，增強(qiáng)分離效果。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)比例為6：94時，三聚氰胺在240nm紫外下檢測，呈現(xiàn)較大的吸收峰，分離效果比較理想。

2.3液相方法的分離范圍

配制濃度一定濃度梯度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為0mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.5mg/L、0.80mg/L、1.00mg/L，利用前述的液相設(shè)備和條件，檢測這一系列濃度梯度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)果表明，在上述濃度范圍內(nèi)，三聚氰胺的濃度與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，規(guī)定本實(shí)驗(yàn)的檢測限為0.5mg/kg，定量限為1mg/kg，所以，如果乳制品樣品中的三聚氰胺的含量低于0.5mg/kg，則視為不含三聚氰胺，一旦檢測結(jié)果顯示三聚氰胺的含量高于0.5mg/ kg，則視為乳制品中添加了三聚氰胺，需要向質(zhì)監(jiān)局報告。

2.4回收率和精度

利用上述色譜條件，對乳制品樣品進(jìn)行檢測，同時設(shè)置空白和平行試驗(yàn)，平行試驗(yàn)的量都是1mg/kg，遵照規(guī)定的試驗(yàn)流程進(jìn)行操作，對樣品進(jìn)行處理，然后依據(jù)上文給出的公式計算三聚氰胺的含量和回收率，結(jié)果顯示，該色譜條件的平均回收率分別是為89.9%和90.1%。

2.5該色譜方法的實(shí)際應(yīng)用

2008年9月份和10月份，分別采集某市14家具備一定規(guī)模的奶牛養(yǎng)殖基地。以上述建立的色譜方法對采集到的乳制品樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有一家奶牛場生產(chǎn)的乳制品中三聚氰胺的含量為0.587mg/ kg，超出了最低檢測限，然后我們對該樣品進(jìn)行了10次平行檢測，結(jié)果不變，因此可以認(rèn)為該奶牛場生產(chǎn)的乳制品存在違規(guī)添加三聚氰胺的行為，需要報告至質(zhì)監(jiān)局。

3結(jié)語

乳制品的傳統(tǒng)檢測，采用的是凱氏定氮法，該方法通過檢測氮的含量，來確定乳制品中蛋白質(zhì)的含量，不法商家利用該漏洞，添加含氮量高的三聚氰胺，以造成蛋白含量高的假象。

利用本文建立的液相色譜方法對乳制品中的三聚氰胺進(jìn)行檢測，結(jié)果表明本文建立的方法具有穩(wěn)定的凈化效果，且檢測限很低，方法的可重復(fù)性好，回收率高且穩(wěn)定，回收率均在89%以上，檢測方便，具備很強(qiáng)的可操作性。能檢測到含量在檢測限0.5mg/kg以下的乳制品中三聚氰胺的含量，這樣基本上保證了三聚氰胺添加行為不再漏網(wǎng)。

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