穿山龍總皂苷對大鼠滑膜細(xì)胞株VEGF與AP-1的影響*

高亞賢，王永為，郭亞春，宋鴻儒，肖麗君，安高，梁秀軍，翟澤玲，段一娜

(承德醫(yī)學(xué)院1.免疫學(xué)教研室；2.人體解剖學(xué)教研室；3.病原生物學(xué)教研室；4.預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，承德 067000)

·藥物研究·

穿山龍總皂苷對大鼠滑膜細(xì)胞株VEGF與AP-1的影響*

高亞賢1，王永為2，郭亞春3，宋鴻儒1，肖麗君1，安高1，梁秀軍1，翟澤玲1，段一娜4

(承德醫(yī)學(xué)院1.免疫學(xué)教研室；2.人體解剖學(xué)教研室；3.病原生物學(xué)教研室；4.預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，承德 067000)

目的 觀察含穿山龍總皂苷血清對大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)mRNA和激活蛋白-1(AP-1)活性的影響，探討其抑制血管新生的作用機(jī)制。方法 制備含穿山龍總皂苷和雷公藤(陽性對照)血清。將培養(yǎng)好的大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364分為空白對照組、模型對照組、含雷公藤多苷血清組和含穿山龍總皂苷血清組，培養(yǎng)1 h，除空白對照組外，其余各組加入IL-17和TNF-α(均為10 μg·L-1)共同孵育24 h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測各組細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)，凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)法(EMSA)檢測各組細(xì)胞核蛋白提取物AP-1 的DNA結(jié)合活性。結(jié)果 與空白對照組比較，模型對照組VEGF mRNA表達(dá)水平及AP-1 DNA結(jié)合活性顯著增高(P<0.05，P<0.01)；與模型對照組比較，含雷公藤多苷血清組、含穿山龍總皂苷血清組VEGF mRNA表達(dá)水平及AP-1 DNA結(jié)合活性均降低(P<0.05)，且兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 含穿山龍總皂苷血清可以抑制VEGF mRNA表達(dá)水平及AP-1 DNA結(jié)合活性，其機(jī)制可能是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1來調(diào)控血管新生關(guān)鍵因子VEGF產(chǎn)生，進(jìn)而抑制血管新生。

穿山龍總皂苷；關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；血管新生；RSC-364；血管內(nèi)皮生長因子；激活蛋白-1

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因尚未明了的慢性自身免疫性功能障礙性疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管新生和血管翳的形成，在RA的發(fā)生發(fā)展過程中起至關(guān)重要的作用。血管新生是產(chǎn)生和維持RA血管翳的必需條件，因此，抑制血管新生可能是治療RA的一個新靶點(diǎn)。筆者前期研究已經(jīng)證實(shí)，穿山龍總皂苷抑制血管新生與抑制滑膜血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)表達(dá)有關(guān)[1]。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)可以影響VEGF的表達(dá)[2]。在前期研究基礎(chǔ)上，筆者以白細(xì)胞介素17 (interleukin-17,IL-17)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364細(xì)胞模型為研究對象，通過觀察穿山龍總皂苷對VEGF mRNA及AP-1活性的影響，從基因水平及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)一步了解穿山龍總皂苷抑制血管新生的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Wistar大鼠30只，雄性，體質(zhì)量(260±20) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動物合格證號：0248274，動物許可證號：SCXK(京)2009-0004。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，攝食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。動物房自然光線，溫度、相對濕度分別維持在約20 ℃、70%。

1.2 細(xì)胞 大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364由河北醫(yī)科大學(xué)惠贈。

1.3 藥物與試劑 穿山龍總皂苷[承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提取，含量：6.5%。通過大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大的因素：乙醇濃度、加熱溫度、不同提取時(shí)間，以提取物中薯蕷皂苷元含量和轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定薯蕷皂苷元含量；采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選穿山龍總皂苷最佳提取工藝，優(yōu)選后的穿山龍總皂苷最佳提取工藝為穿山龍飲片分別加入10倍和8倍量50%乙醇，85 ℃加熱回流1 h，過濾，收集濾液，合并兩次濾液，回收乙醇，噴霧干燥]；雷公藤多苷片(黃石飛云制藥有限公司，規(guī)格：每片10 mg，批號：Z42021212)；Trizol Reagent 購自Invitrogen公司，批號：15596-026；RT master Mix以及Taq DNA polymerase購自大連寶生物公司，批號分別為DRR036s，DRR039s；Nuclear Extract Kit購自美國Active Motif公司，批號：40010；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白含量測定試劑盒，購自美國Pierce公司，批號：23227；DIG Gel Shift Kit地高辛凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)試劑盒購自德國Roche公司，批號：03353591510；AP-1探針由上海基峰生物科技有限公司設(shè)計(jì)。

1.4 儀器 SLAN熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Real-time PCR Detection System)：上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.5 含藥血清的制備與大鼠分組和給藥方法 將穿山龍總皂苷和雷公藤多苷片分別溶于純化水中，制成懸濁液。取Wistar大鼠30只，采用隨機(jī)分組方法，根據(jù)隨機(jī)分組表分組選取15只大鼠給予穿山龍總皂苷100 mg·kg-1·d-1，灌胃，另外15只大鼠給予雷公藤多苷片120 mg·kg-1·d-1，灌胃。均連續(xù)灌胃7 d，第8天給藥1 h后，下腔靜脈無菌取血，離心取血清，過濾除菌備用。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測VEGF mRNA表達(dá)水平

1.6.1 細(xì)胞分組及處理 選用處于對數(shù)生長期的RSC-364細(xì)胞，消化后制成2×104個·mL-1細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔2 mL。將細(xì)胞分為空白對照組、模型對照組、含雷公藤皂苷血清組和含穿山龍總皂苷血清組，每組設(shè)復(fù)孔6個，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿6孔板80%后，將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸出棄去，空白對照組和模型對照組分別加入培養(yǎng)液和20%正常大鼠血清，含雷公藤皂苷血清組和含穿山龍總皂苷血清組分別加入培養(yǎng)液及20%含雷公藤皂苷血清(在加入細(xì)胞的培養(yǎng)液總體積中，大鼠含藥血清體積占20%，其他正?；炯?xì)胞培養(yǎng)液如胎牛血清等占80%)和20%含穿山龍總皂苷血清，均培養(yǎng)1 h，除空白對照組外，其余各組加入TNF-α(10 μg·L-1)+IL-17(10 μg·L-1)，共同孵育24 h。

1.6.2 總RNA提取及cDNA合成 取“1.6.1”項(xiàng)培養(yǎng)的細(xì)胞，棄去上清液，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA純度和濃度，取純度較好的樣品(260 nm/280 nm比值均在2.0～2.2)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，cDNA置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 PCR擴(kuò)增VEGF VEGF及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldelyde-3-phosphate dehydrogonse,GAPDH)的引物、探針由大連寶生物公司合成(序列見表1)。反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s 、95 ℃、10 s，60 ℃、30 s擴(kuò)增循環(huán)40個，60 ℃讀取熒光。每個樣品設(shè)平行復(fù)孔3個取平均值。依據(jù)所得目的基因與內(nèi)參基因Ct值(Ct值即每個反應(yīng)孔內(nèi)熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù))，用內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，按照2-ΔΔCt法[3]對基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析，ΔΔCt=(待測組目的基因Ct均值-待測組內(nèi)參照基因Ct均值)-(對照組目的基因Ct均值-對照組內(nèi)參照基因Ct均值)。2-ΔΔCt代表目的基因在不同組織的相對表達(dá)量，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

1.7 凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)法(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測AP-1 DNA結(jié)合活性

1.7.1 細(xì)胞分組及處理 同“1.6.1”項(xiàng)。

1.7.2 滑膜細(xì)胞核蛋白的提取 參照Nuclear Extract Kit說明書的操作步驟，提取滑膜細(xì)胞核蛋白，采用BCA分析法測定樣本核蛋白濃度，將核蛋白分裝置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 VEGF與GAPDH引物與探針序列

1.7.3 EMSA檢測滑膜細(xì)胞核蛋白提取物AP-1的DNA結(jié)合活性 將適量核蛋白抽提物與地高辛標(biāo)記的AP-1寡核苷酸探針結(jié)合，AP-1探針序列如下，P1：5′-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3′；P2：5′-TTCCGGCTGAGTCATCAAGCG-3′。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陰性對照組，只加入探針?biāo)幬镒鳛閰⒄?。反?yīng)產(chǎn)物經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，加化學(xué)發(fā)光底物(chemiluminescence substrate,CSPD)，X線膠片曝光，然后顯影、定影，凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，以灰度值對轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)記探針結(jié)合活性進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組滑膜細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá) SLAN熒光定量PCR檢測系統(tǒng)擴(kuò)增儀完成PCR反應(yīng)后，自動生成熒光強(qiáng)度曲線，見圖1。模型對照組VEGF目的基因表達(dá)量(3.67±0.51)，明顯高于空白對照組[(1.0±0.28)，P<0.05]。含雷公藤皂苷血清組、含穿山龍總皂苷血清組VEGF目的基因表達(dá)量分別為(1.54±0.24)，(1.23±0.43)，與模型對照組比較，均明顯降低(P<0.05)，兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組滑膜細(xì)胞核蛋白提取物AP-1的DNA結(jié)合活性 與空白對照組(112.5±8.2)比較，模型對照組滑膜細(xì)胞核蛋白提取物AP-1 DNA結(jié)合活性(221.0±12.7)顯著增高 (P<0.01)；與模型對照組比較，含雷公藤血清組和含穿山龍總皂苷血清組AP-1 DNA結(jié)合活性[分別為(116.5±8.2)和(118.0±10.9)]降低(P<0.05)，兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

control：空白對照組；IL-17+TNF-α：模型對照組；TP：含雷公藤皂苷血清組；RDN：含穿山龍總皂苷血清組

圖1 VEGF和GAPDH擴(kuò)增曲線

control：blank control group；IL-17+TNF-α：model control group；TP：tripterygium medicated serum group；RDN：total saponins medicated serum group

Fig.1 Amplification curve of VEGF and GAPDH

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，其主要病理特征為關(guān)節(jié)滑膜增生、血管翳形成及對稱性、破壞性關(guān)節(jié)病變，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。血管新生是產(chǎn)生和維持RA血管翳的必要條件，在促進(jìn)RA發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[4-5]。

RA滑膜組織表達(dá)許多促血管生成因子，它們在RA血管生成的過程中發(fā)揮了重要作用，其中對VEGF的研究較為深入。VEGF是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，屬于血小板源生長因子家族成員，是促血管生成的主要因素之一。VEGF及其受體調(diào)控著內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成等重要環(huán)節(jié)，在血管新生中起著非常關(guān)鍵的作用[6]。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞更新緩慢，VEGF低表達(dá)，在RA患者的活組織檢查中發(fā)現(xiàn)，滑膜細(xì)胞中VEGF的釋放顯著升高[7]。臨床研究表明，RA患者的外周血VEGF越高，其受累的關(guān)節(jié)數(shù)目越多，關(guān)節(jié)病變越嚴(yán)重，并認(rèn)為外周血的VEGF值可以作為像血沉一樣反映RA患者病情嚴(yán)重程度的一項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)[8]。雷公藤是目前治療RA藥物中療效已被肯定的中藥[9]，雷公藤多苷是其主要成分。近年來，一系列文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤能夠下調(diào)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠滑膜組織VEGF的表達(dá)，抑制血管新生[10]。以往的研究均采用常規(guī)RT-PCR的方法，定量不準(zhǔn)確，變異性較大。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對各細(xì)胞組VEGF mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示IL-17+TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞模型對照組VEGF目的基因表達(dá)量升高，含穿山龍總皂苷血清組VEGF目的基因表達(dá)量顯著降低，其效果與含雷公藤血清組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示穿山龍總皂苷可能通過抑制VEGF的表達(dá)進(jìn)而減少血管新生，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致。

1.陰性對照組；2.空白對照組；3.模型對照組；4.含雷公藤皂 與空白對照組比較，*1P<0.01;與模型對照組比較，*2P<

苷血清組；5.含穿山龍總皂苷血清組 0.05

圖2 4組AP-1的DNA結(jié)合活性比較(EMSA)

1.negative control group；2.blank control group;3.model control Compared with blank control group，*1P<0.01; compared

group;4.tripterygium medicated serum group;5.total saponins from with model group，*2P<0.05

RhizmaDioscreneNipponicaemedicated serum group

Fig.2 Comparison of DNA-bonding activity of AP-1 among four groups (EMSA)

AP-1是一類由早期反應(yīng)基因編碼而成的對氧化還原敏感的核轉(zhuǎn)錄因子，是由癌基因Fos和Jun家族的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子組合成的二聚體，其中c-fos和c-jun形成的異源二聚體是AP-1的主要形式，AP-1能直接或間接地識別或結(jié)合在同一順式作用元件8-12bp核心序列上，參與許多生長因子和細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致機(jī)體一系列生理病理變化[11]。ASAHARA等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，RA 和CIA小鼠滑膜組織中 AP-1 活性明顯高于骨關(guān)節(jié)炎，并主要定位于滑膜襯里層成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte,FLSs)中。BOYLE等[14]從 CIA 小鼠滑膜組織中也觀察到 AP-1 活性增高早于關(guān)節(jié)炎癥狀的出現(xiàn)以及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。在VEGF的基因中含有Jun/Fos二聚體即轉(zhuǎn)錄因子AP-1結(jié)合位點(diǎn)，佛波酯可以誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因c-jun/c-fos的表達(dá)來促進(jìn)此位點(diǎn)的形成，進(jìn)而與VEGF的基因結(jié)合來增強(qiáng)VEGF表達(dá)。有研究顯示，雷公藤內(nèi)酯醇能抑制佛波酯誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的合成和分泌，也可以抑制原癌基因c-jun/c-fos mRNA在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，提示TP可能通過抑制AP-1的形成，來影響VEGF的表達(dá)[2]。另有研究也表明，雷公藤可能通過抑制AP-1蛋白復(fù)合體的結(jié)合，抑制VEGF的合成[15]。在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞核蛋白提取物中AP-1的DNA結(jié)合活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17和TNF-α聯(lián)合刺激可使AP-1的DNA結(jié)合活性顯著增強(qiáng)，加入含穿山龍總皂苷血清可使IL-17和TNF-α聯(lián)合刺激RSC-364細(xì)胞的AP-1的DNA結(jié)合活性減弱，且與含雷公藤血清組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明穿山龍總皂苷可能抑制AP-1的活性，同時(shí)，前面實(shí)驗(yàn)已進(jìn)一步證實(shí)穿山龍總皂苷可以顯著降低VEGF mRNA水平，推測如文獻(xiàn)報(bào)道[15]，穿山龍總皂苷可能通過抑制AP-1來下調(diào)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管新生。

綜上所述，本研究應(yīng)用IL-17和TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364細(xì)胞模型，證實(shí)了穿山龍總皂苷含藥血清可以抑制VEGF mRNA的表達(dá)水平及AP-1的DNA結(jié)合活性，考慮穿山龍總皂苷可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1來調(diào)控血管新生關(guān)鍵因子VEGF的產(chǎn)生，進(jìn)一步抑制RA血管新生。然而，細(xì)胞內(nèi)存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路形成精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不同途徑之間存在多種交互的聯(lián)系，這給信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究帶來了困難，關(guān)于穿山龍總皂苷抑制VEGF調(diào)控機(jī)制如何，仍有待進(jìn)一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.001

Effects of Total Saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicaeon VEGF and AP-1 in Rat Synovial Cell Strain

GAO Yaxian1，WANG Yongwei2，GUO Yachun3，SONG Hongru1，XIAO Lijun1，AN Gao1，LIANG Xiujun1，ZHAI Zeling1，DUAN Yina4

(1.DepartmentofImmunology；2.DepartmentofHumanAnatomy；3.DepartmentofPathogenBiology；4.DepartmentofPhylaxiology,ChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China)

Objective To study the effects of medicated serum with total saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicae(RDN) on VEGF mRNA expression and AP-1 activity in rat synovial cell strain RSC-364 induced by IL-17 and TNF-α.To investigate the mechanism about total saponin from RDN inhibition of angiogenesis. Methods Medicated serum of total saponins from RDN and tripterygium (positive control) were prepared.Rat synovial cells RSC-364 were divided into four groups: the blank control，IL-17+TNF-α model，tripterygium medicated serum，and total saponins medicated serum groups.After one hour of incubation，all groups except for the blank control were incubated with both IL-17(10 μg·L-1) and TNF-α(10 μg·L-1) for 24 hours.VEGF mRNA expression in RSC-364 was detected by PrimeScriptTMreal-time quantitative PCR (RT-PCR) detection kit，and the AP-1 DNA-binding activity was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Results Compared with the control blank group，both of the VEGF mRNA expression and AP-1 activity in rat synovial cell strain RSC-364 induced by IL-17 and TNF-α increased remarkably (P<0.05，P<0.01).The VEGF mRNA expression and AP-1 activity in tripterygium medicated serum group and total saponins medicated serum group were remarkably lower than those of the model control group (P<0.05).There was no significant difference between the two medicated serum groups. Conclusion Serum medicated with total saponins from RDN can remarkably decrease VEGF mRNA expression and AP-1 activity，indicating that the total saponins from RDN could influence VEGF secretion by inhibiting the AP-1 signal transduction pathway，VEGF is the key factor of angiogenesis，thereby to restrain angiogenesis.

Total saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicae(RDN)；Arthritis,rheumatoid；Angiogenesis；RSC-364；Vascular endothelial growth factors；activator protein-1

2014-01-18

2014-02-21

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30873420)；河北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(C2007000916)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(ZH200806)

高亞賢(1984-)，女，河北廊坊人，講師，碩士，研究方向：中藥免疫學(xué)。電話：0314-2517004，E-mail：yaxiangao@163.com。

宋鴻儒(1961-)，男，河北承德人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥免疫學(xué)。電話：0314-2291166，E-mail：songhongru@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0285-05