苦橘咳喘合劑的止咳化痰作用與急性毒性

鄧恢進(jìn)，李霞 ，張金美，余永鑫，鄒欣，徐麗君

(1.武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，武漢 430200； 2.武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，武漢 430200；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030)

苦橘咳喘合劑的止咳化痰作用與急性毒性

鄧恢進(jìn)1，李霞1，張金美1，余永鑫2，鄒欣3，徐麗君3

(1.武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，武漢 430200； 2.武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，武漢 430200；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030)

目的 觀察苦橘咳喘合劑的止咳化痰效果，評價其急性毒性。方法 采用小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)、小鼠酚紅實(shí)驗(yàn)、二甲苯小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)和最大耐受量實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)中苦橘咳喘合劑小、中、大劑量組R值分別為112.26%，143.30%，162.07%，分別呈現(xiàn)為無效、有效和顯效；苦橘咳喘合劑大、中劑量組能顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且呈良好量效關(guān)系；苦橘咳喘合劑小 、中、大劑量組均能顯著改善二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度(P<0.01)，且呈良好量效關(guān)系；其最大耐受量為326.76 g·kg-1。結(jié)論 苦橘咳喘合劑中、大劑量具有一定的鎮(zhèn)咳祛痰作用和良好的抗炎效果，且安全性較好。

苦橘咳喘合劑；止咳作用；化痰作用；毒理學(xué)，急性

苦橘咳喘合劑(原名咳喘安口服液)是武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院臨床使用多年的經(jīng)驗(yàn)方，用于治療急慢性氣管炎、支氣管炎等，取得了良好療效。為確?？嚅倏却蟿┌踩?、有效，并為進(jìn)一步申報醫(yī)院內(nèi)制劑奠定基礎(chǔ)，筆者按照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布實(shí)施的《藥品注冊管理辦法》中有關(guān)中藥、天然藥物注冊分類第6類的有關(guān)項(xiàng)目要求，進(jìn)行止咳化痰藥效學(xué)研究和急性毒性研究。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠，體質(zhì)量22～28 g，清潔級，雌雄各半，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物合格證號：SCXK(鄂)2010-0009，使用許可證號：20081293，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，光照時間12 h。

1.2 藥品與試劑 苦橘咳喘合劑(武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院提供，批號：13032501)；急支糖漿(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司提供，批號：z50020615)；阿司匹林腸溶片(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，批號：1210201)； 氨水(武漢聯(lián)堿廠提供，濃度25%～28%，分析純，批號：130106，使用時濃度稀釋至12.5%)；氯化銨(武漢中天化工試劑有限公司提供，分析純，批號：20120910)；苯酚紅(天津市大茂化學(xué)試劑廠提供，批號：20100617)；碳酸氫鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，分析純，批號：F20100607)。

1.3 儀器 Synergr2全能酶標(biāo)儀(美國)；AEL-200 型萬分之一電子分析天平(日本島津公司)。

1.4 小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn) 昆明種小鼠70只，體質(zhì)量20～25 g，雌雄各半。將小鼠逐只放入倒置的500 mL燒杯中，立即將棉球(棉球中注入12.5%氨水2.5 mL)塞入燒杯中，從塞入棉球時開始計(jì)時，記錄3 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期[1-2]。將以下幾種情況的小鼠剔除：①3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)<10次或>80次；②潛伏期<15 s或>50 s；③動物死亡、狀態(tài)不佳、反應(yīng)異常劇烈等。經(jīng)剔除后選取小鼠60只，稱質(zhì)量標(biāo)記后隨機(jī)分為5組，每組12只，即正常對照組，急支糖漿組(13.33 mL·kg-1)，苦橘咳喘合劑小劑量組(6.67 mL·kg-1)、中劑量組(13.33 mL·kg-1)、大劑量組(26.67 mL·kg-1)，連續(xù)灌胃7 d。正常對照組給予等體積純化水。末次給藥前小鼠禁食不禁水12 h，給藥后1 h，將小鼠放入自制引咳裝置中，根據(jù)序貫法原則給予小鼠預(yù)定時間氨水噴霧刺激，立即取出小鼠，觀察1 min內(nèi)小鼠咳嗽次數(shù)，若1 min內(nèi)出現(xiàn)3次以上典型咳嗽動作，即腹肌或胸腔收縮同時張大嘴，有時可有咳嗽聲，算作有咳嗽，記作“+”；否則算作無咳嗽，記作“-”。計(jì)算引起半數(shù)小鼠咳嗽所需的噴霧時間(EDT50)，計(jì)算R值，若130%

1.5 小鼠酚紅祛痰實(shí)驗(yàn) 昆明種小鼠72只，體質(zhì)量20～25 g，雌雄各半，稱質(zhì)量標(biāo)記后按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組12只，即正常對照組，氯化銨組(10.00 mL·kg-1)，急支糖漿組(13.33 mL·kg-1)，苦橘咳喘合劑小劑量組(6.67 mL·kg-1)、中劑量組(13.33 mL·kg-1)、大劑量組(26.67 mL·kg-1)，連續(xù)灌胃7 d，正常對照組給予等體積純化水。末次給藥前小鼠禁食不禁水12 h，給藥后30 min，腹腔注射0.5%酚紅0.9%氯化鈉溶液0.5 mL，注射后30 min處死小鼠，剪開頸正中皮膚，分離并剪下自甲狀軟骨下至支氣管分支處的一段氣管，將各氣管段放入預(yù)先盛有5%碳酸氫鈉溶液1 mL的 EP管中，超聲震蕩，使氣管段中的酚紅完全釋放，546 nm處測吸光度(A)值，根據(jù)回歸方程計(jì)算出酚紅的含量[3-4]。酚紅含量 =(A-0.056 2)/0.044 4，R2=0.989 8。

1.6 小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn) 雄性昆明種小鼠72只，體質(zhì)量20～25 g，稱質(zhì)量標(biāo)記后隨機(jī)分為6組，每組12只，即正常對照組、阿司匹林組(200 mg·kg-1)、急支糖漿組(13.33 mL·kg-1)、苦橘咳喘合劑小劑量組(6.67 mL·kg-1)、苦橘咳喘合劑中劑量組(13.33 mL·kg-1)、苦橘咳喘合劑大劑量組(26.67 mL·kg-1)，連續(xù)灌胃7 d，正常對照組給予等體積純化水。末次給藥前小鼠禁食不禁水12 h，給藥后30 min，將致炎劑二甲苯30 μL均勻涂在小鼠右耳前后兩面，致炎后30 min頸部脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8 mm打孔器在兩耳同一部位打下圓耳片，電子分析天平稱質(zhì)量[5]。計(jì)算腫脹度和腫脹率。腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量；腫脹率(%)=(右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量)/左耳片質(zhì)量×100%。

1.7 苦橘咳喘合劑最大耐受量測定 昆明種小鼠40只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分成2組，即正常對照組和苦橘咳喘合劑組，每組20只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，苦橘咳喘合劑組以11.67 g·mL-1苦橘咳喘合劑藥液，按最大容積0.7 mL·20 g-1分兩次給予小鼠灌胃，給藥劑量為326.76 g·kg-1(按生藥量計(jì))；正常對照組同法給予同體積對照溶液(0.5%羧甲基纖維素鈉溶液)，兩次用藥時間相隔8 h。觀察動物體質(zhì)量變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物等，記錄所有動物的死亡情況、中毒癥狀及中毒反應(yīng)的起始時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間等。對于瀕死及死亡動物進(jìn)行大體解剖，其他動物在觀察期結(jié)束后進(jìn)行大體解剖。肉眼觀察主要臟器的體積、顏色、質(zhì)地等情況；若出現(xiàn)異常則對改變器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[6]。 共觀察7 d，詳細(xì)觀察給藥后4 h內(nèi)動物的反應(yīng)情況，每天上、下午各觀察1次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0版統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；并采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行陽性率的比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 止咳作用 中、大劑量苦橘咳喘合劑對模型小鼠有較好的止咳作用。結(jié)果見表1。

表1 5組小鼠止咳效果比較

Tab.1 Comparison of cough relieving effect among five groups of mice

組別小鼠數(shù)劑量/(mL·kg-1)EDT50/sR值/%止咳效果正常對照組12…26.1……急支糖漿組1213.3332.9126.05無效苦橘咳喘合劑 小劑量組116.6729.3112.26無效 中劑量組1113.3337.4143.30有效 大劑量組1226.6742.3162.07顯效

2.2 祛痰作用 結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，苦橘咳喘合劑小、中、大劑量組在增加小鼠氣管酚紅排泌量方面呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，其中，中、大劑量組能顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；而急支糖漿組表現(xiàn)為無效，與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 6組小鼠氣管酚紅排泌量比較

Tab.2 Comparison of phenolsulfonphthalein excretion in the trachea among six groups of mice±s

與正常對照組比較，t=6.236，*1P<0.01，t=2.031，*2P<0.01，t=0.957，*3P<0.05，t=0.957，*4P<0.05，t=2.140，*5P<0.01，t=4.846，*6P<0.01

Compared with normal control group，t=6.236，*1P<0.01，t=2.031，*2P<0.01，t=0.957，*3P<0.05，t=0.957，*4P<0.05，t=2.140，*5P<0.01，t=4.846，*6P<0.01

2.3 抗炎作用 與正常對照組比較，苦橘咳喘合劑小、中、大劑量組小鼠耳腫脹均明顯改善(均P<0.01)。結(jié)果見表3。

表3 6組小鼠耳廓腫脹情況比較

Tab.3 Comparison of auricle swelling among six groups of mice±s

與正常對照組比較，5.175≤t≤14.581，*1P<0.01

Compared with normal control group，5.175≤t≤14.581，*1P<0.01

2.4 苦橘咳喘合劑最大耐受量 苦橘咳喘合劑組動物于給藥后4 h內(nèi)，用藥組活動減少。1周內(nèi)，兩組小鼠的攝食、飲水、糞便、膚色、黏膜、皮毛、呼吸等均未發(fā)生異常，且各組小鼠均無死亡。兩組小鼠體質(zhì)量及其體質(zhì)量增加百分率均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，結(jié)果見表4；7 d后，動物處死，作系統(tǒng)尸檢，結(jié)果各主要臟器均未發(fā)現(xiàn)異常變化。提示苦橘咳喘合劑口服給藥的最大耐受量為326.76 g·kg-1(按生藥量計(jì))，按千克體質(zhì)量計(jì)算相當(dāng)于每日臨床劑量的333.4倍；按動物系數(shù)折算相當(dāng)于每日臨床劑量的33.3倍。見表4。

表4 小鼠最大耐受量實(shí)驗(yàn)中體質(zhì)量變化

Tab.4 Changes of body weight of mice in maximum tolerance dose experiment±s

3 討論

苦橘咳喘合劑由苦杏仁、橘紅、生石膏、蒲公英等中藥組成，具有宣肺平喘、化痰止咳的功效。該藥在多年臨床應(yīng)用中治療急慢性氣管炎、支氣管炎等療效確切。本實(shí)驗(yàn)通過小鼠氨水引咳實(shí)驗(yàn)、小鼠酚紅祛痰實(shí)驗(yàn)和小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該制劑具有較好的抗炎止咳化痰作用。由于在多年臨床應(yīng)用中，未有發(fā)現(xiàn)患者反饋其不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中無法測得半數(shù)致死量，故只能進(jìn)行最大耐受量測定，結(jié)果表明其最大耐受量是能夠達(dá)到的最大口服給藥量，觀察期內(nèi)未見任何毒性反應(yīng)及死亡情況，說明該制劑急性毒性較小，可以推廣應(yīng)用于臨床。

[1] 楊建宏，王莉，馬豐才.提取物鎮(zhèn)咳祛痰抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥藥理與臨床，2010，26(1)：51-52.

[2] 徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：886.

[3] 陳鋼，陳金和，吳勇.復(fù)方咳喘合劑的藥效學(xué)研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2004，23(9)：626-627.

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則(征求意見稿)-中藥、天然藥物分冊[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2003：23-25.

[5] 鄔姍，何開勇，潘望平，等.金柴抗感膠囊解熱抗炎止咳作用研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32(3)：313-315.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南(藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)) [M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：203-204.

DOI 10.3870/yydb.2015.05.009

Eliminating Phlegm and Stopping Cough byKujyukekuanMixtures and Its Acute Toxicity

DENG Huijin1, LI Xia1,ZHANG Jinmei1,YU Yongxin1, ZOU Xin2, XU Lijun2

(1.DepartmentofPharmacy,2.ChineseInternalMedicine,HospitalofTraditionalChineseMedicine,JiangxiaDistrict,Wuhan430200,China;3.InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Objective To study the relieving cough and reducing phlegm effects and acute toxicity of theKujyukekuanmixtures. Methods The method used in our study is a cough model induced by the ammonia water , the phenol red test in mice，the mouse pinna swelling model induced by xylene and the maximum tolerant dose test. Results In antitussive experiments, R value ofKujyukekuanmixtures at low, medium and high dose of was 112.26%, 143.30%, 162.07%, respectively regarding as ineffective, effective and marked effective;Kujyukekuanmixtures at medium and high doses increased the excretion of phenolsulfonphthalein in the trachea of mice (compared with the normal control group,P<0.05 orP<0.01)，the results showed good concentration-response relationship；Kujyukekuanmixtures at low, medium and high dose significantly reduced mouse auricle swelling caused by xylene (compared with normal control group,P<0.01), the results presented a good concentration-response relationship; the MTD ofKujyukekuanmixture was 326.76 g·kg-1. ConclusionKujyukekuanmixtures at medium and high doses exert significant eliminating cough and phlegm effects and strong anti-inflammatory property, and are safe.

Kujyukekuanmixtures；Relieving cough effects; Reducing phlegm effects； Toxicity,acute

2013-09-02

2013-11-27

鄧恢進(jìn)(1967-)，男，湖北武漢人，副主任藥師，學(xué)士，研究方向：中藥制劑。電話：027-87013947，E-mail：dhjmm@163.com。

徐麗君(1966-)，女，湖北武漢人，副主任藥師，研究方向：中藥化學(xué)及中藥藥理。電話：027-83663660，E-mail：xli0904@tjh.tjmu.edu.com。

R286；R285.5

A

1004-0781(2015)05-0603-03