• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    單糖柱前PMP衍生HPLC測定方法探討

    2015-06-23 16:22:12朱照武向春林向玲芳莫開菊
    關(guān)鍵詞:醛酸三氯甲烷單糖

    朱照武,莊 洋,向春林,趙 娜,李 珊,向玲芳,莫開菊?

    (1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 恩施 445000;2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院),湖北 恩施 445000)

    單糖柱前PMP衍生HPLC測定方法探討

    朱照武1,2,莊 洋1,2,向春林1,2,趙 娜2,李 珊1,2,向玲芳1,2,莫開菊1,2?

    (1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 恩施 445000;2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院),湖北 恩施 445000)

    從PMP萃取酸度、萃取次數(shù)探討了柱前PMP衍生方法對單糖-PMP衍生物的影響,并從流動相比例、緩沖液pH值、緩沖鹽濃度三個方面對單糖柱前衍生HPLC的分離效果進(jìn)行了優(yōu)化研究.結(jié)果表明:單糖進(jìn)行PMP衍生后,用HCl中和至pH為7.0,能最大限度避免單糖-PMP衍生產(chǎn)物的損失;使用三氯甲烷萃取PMP三次時,能在除去PMP的情況下避免單糖-PMP衍生產(chǎn)物的損失;降低流動相中有機(jī)相的比例或提高緩沖液的pH值,有利于色譜峰分離度的提高;提高緩沖鹽濃度,有利于保持色譜峰的對稱性.

    單糖;PMP衍生物;高效液相色譜;分離度;不對稱因子

    多糖類物質(zhì)廣泛存在于自然界中,近年來,我國對植物多糖展開了廣泛的研究,植物多糖的藥理活性是研究的重點(diǎn)[1-4].多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的,多糖的單糖組成作為一級結(jié)構(gòu)的主要內(nèi)容,自然成為研究多糖生物活性的基礎(chǔ)[5].糖類物質(zhì)因不具有發(fā)色基團(tuán)不能直接使用紫外和熒光檢測而限制了分析手段的應(yīng)用,自1989年Honda等[6-8]首次在弱堿性條件下成功實(shí)現(xiàn)PMP糖類衍生,使糖類被標(biāo)記上紫外吸收基團(tuán),具有強(qiáng)烈的紫外吸收,糖類的分析方法就得到快速發(fā)展.其中,PMP柱前衍生化HPLC分析成為糖類分析的重要方法.楊興斌等[9]建立了當(dāng)歸多糖單糖組成的PMP柱前衍生化HPLC方法,Lv等[10]利用PMP柱前衍生化HPLC法分析出綠茶多糖由甘露糖、木糖、阿拉伯糖等9種單糖組成.

    盡管PMP在糖類檢測方面具有優(yōu)越性,但是糖類-PMP衍生方法仍存在一定不足.有報道指出,PMP衍生產(chǎn)物易丟失1分子PMP,且PMP試劑的疏水性偏低,多次萃取難以完全去除,萃取過程也會引起部分樣品的損失[11].Castells[12]也報道過PMP萃取過程會導(dǎo)致衍生產(chǎn)物的損失.此外,戴軍[13]對三氯甲烷萃取時溶液的酸度進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)溶液偏堿性時衍生產(chǎn)物在三氯甲烷中有一定的溶解度,會造成損失,這與Strydom[14]的研究結(jié)果一致;若萃取時溶液偏酸性,衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定,也會造成結(jié)果偏低.

    單糖種類繁多,許多植物多糖的單糖組成復(fù)雜,經(jīng)常需要調(diào)整液相色譜條件使各種單糖衍生物的色譜峰達(dá)到完全分離.在色譜柱固定的條件下,色譜峰的分離效果很大程度取決于流動相,因此,了解流動相對色譜峰分離效果及峰形的影響有利于在不同條件下獲得良好的單糖衍生物色譜圖.

    本文從單糖的PMP衍生方法及衍生產(chǎn)物的HPLC分離兩個方面進(jìn)行探討,為單糖柱前PMP衍生HPLC方法的優(yōu)化提供一定的理論依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖 德國Dr.Ehrenstorfer公司;D-葡萄糖、L-巖藻糖 美國sigma公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈 色譜純 美國TEDIA天地試劑公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷均為國產(chǎn)分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

    1.2 儀器與設(shè)備

    P680 ALPG高效液相色譜儀,包括DAD-100檢測器、TCC-100柱溫箱和Chromeleon色譜工作站(戴安中國有限公司);MS1 Minishaker漩渦混合器(德國IKA公司);GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司).

    1.3 方法

    1.3.1 單糖的衍生 分別配制一定濃度的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及巖藻糖的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.各標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取50 μL置于5 mL的具塞試管中,各加50 μL 0.6mol/L的NaOH溶液,漩渦混勻;再加100μL0.5mol/L的PMP甲醇溶液,漩渦混勻,在70℃的烘箱中避光反應(yīng)100min,取出避光放置10min冷卻至室溫,加一定量的0.3 mol/L的HCL,加水至2 mL,再加2 mL的三氯甲烷,漩渦混勻,靜置,棄去三氯甲烷相,如此萃取幾次.將水相用0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進(jìn)行分析.

    1.3.2 高效液相色譜分析 色譜條件:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:A液:0.1mol/L的pH6.7磷酸鉀鹽緩沖液,B液:乙腈;柱溫:30℃;檢測波長:250 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣體積:20μL.

    1.3.3 萃取酸度對PMP衍生產(chǎn)物的影響 衍生反應(yīng)結(jié)束后,待混合標(biāo)準(zhǔn)液冷卻至室溫,分別加入80、90、100、110、120μL 0.3mol/L的鹽酸,加水至2mL,同1.3.1法萃取、過0.45μm微孔膜后進(jìn)行HPLC分析.

    1.3.4 萃取過程對PMP殘留及衍生產(chǎn)物的影響 樣品按1.3.1衍生中和后,加入三氯甲烷,漩渦混勻10s間隔5s,重復(fù)3次后,靜置,棄去三氯甲烷層,如此分別萃取1、2、3、4、5次.樣品過0.45μm微孔膜后進(jìn)行HPLC分析.

    1.3.5 流動相比例對單糖衍生物的分離度影響 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液進(jìn)行PMP衍生后,分別在流動相比例為A液∶B液=80∶20、81∶19、82∶18、83∶17的條件下進(jìn)行HPLC分析,比較色譜峰的分離度R.

    1.3.6 流動相pH值對單糖衍生物的分離度影響 分別配制pH為6.5和6.7的0.1 mol/L的磷酸鉀鹽緩沖液為A液,以最佳流動相比例對單糖衍生物進(jìn)行HPLC分析,比較色譜峰的分離度R.

    1.3.7 磷酸緩沖鹽濃度對色譜峰對稱性的影響 分別配制濃度為0.01、0.05、0.1mol/L pH6.7的磷酸鉀鹽緩沖液作為流動相A液,在最佳流動相比例下,對葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖四種單糖衍生物進(jìn)行HPLC分析,比較色譜峰的不對稱因子As.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 萃取酸度對PMP衍生產(chǎn)物的影響

    PMP衍生結(jié)束后,加入HCl中和,在中性條件下,利用三氯甲烷萃取出多余的PMP,保留單糖-PMP衍生產(chǎn)物.萃取時溶液環(huán)境偏酸或偏堿均會對單糖-PMP衍生產(chǎn)物造成影響,如表1,若溶液偏堿性,則單糖-PMP衍生物的峰面積低于完全中和時的測定結(jié)果,若中和過度,溶液偏酸性,單糖-PMP衍生物的峰面積也低于完全中和時的測定結(jié)果.總之,萃取時溶液偏酸或偏堿均會影響試驗(yàn)結(jié)果,這與戴軍[13]的研究一致.

    試驗(yàn)結(jié)果表明,萃取酸度對不同單糖衍生物的影響不同,對葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的PMP衍生產(chǎn)物的影響最大,對甘露糖和鼠李糖的PMP衍生物的影響最小.溶液呈中性時,八種單糖-PMP衍生物峰面積的總和最大.

    2.2 萃取過程對PMP殘留的影響萃取時,若PMP萃取不徹底,HPLC圖譜中PMP峰明顯,影響圖譜效果;若PMP萃取過度,可能會造成單糖-PMP衍生產(chǎn)物的損失.分別對混合標(biāo)準(zhǔn)品的衍生液萃取1、2、3、4、5次后的結(jié)果如圖

    1和表2.

    圖1 三氯甲烷萃取次數(shù)對PMP的影響Fig.1 Effects of chloroform extrction times on PMP

    表1 中和對萃取過程中單糖-PMP衍生物的影響Tab.1 Effects of neutralization before extraction on derivatives

    三氯甲烷萃取一次時,溶液中單糖-PMP衍生產(chǎn)物的峰面積最大,但PMP殘留嚴(yán)重,峰面積大于單糖-PMP衍生產(chǎn)物,當(dāng)萃取次數(shù)達(dá)到3次時,PMP殘留量較低,不影響圖譜效果,萃取4次時圖譜上已無明顯PMP峰.

    但隨著萃取次數(shù)的增加,單糖-PMP衍生物的含量卻逐步降低,萃取5次時,單糖-PMP衍生物的含量出現(xiàn)明顯下降.因此,綜合考慮單糖-PMP衍生物的保留、PMP的去除以及萃取工作量,選擇萃取3次較合適.

    2.3 流動相比例對單糖衍生物分離度的影響

    在實(shí)驗(yàn)條件下,8種單糖衍生物的保留順序依次為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖.四種流動相比例條件下,8種單糖衍生物的色譜峰分離效果如圖2.

    表2 三氯甲烷萃取次數(shù)對單糖-PMP衍生物的影響Tab.2 Effects of chloroform extrction times on derivatives

    圖2 流動相比例對色譜峰分離度的影響Fig.2 Effects of moblie phase ratio on seperation of peaks

    由圖2看出,pH6.7的緩沖液∶乙腈=80∶20時,鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的色譜峰完全重疊,且與半乳糖醛酸衍生物不能完全分離;隨著緩沖液比例的提高,鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸衍生物色譜峰的分離度逐漸提高,當(dāng)緩沖液比例提高到82%時,8種單糖衍生物達(dá)到完全分離;繼續(xù)提高緩沖液比例至83%時,分離效果進(jìn)一步改善.4種流動相比例下,各單糖衍生物色譜峰的分離度R如表3,提高緩沖液比例降低有機(jī)相比例時,色譜峰的分離度R提高,但保留時間延長,流動相比例為83∶17時,樣品運(yùn)行時間長達(dá)50 min.因此,選擇剛好能使八種單糖衍生物完全分離的流動相比例,即pH6.7磷酸緩沖液 ∶乙腈=82∶18.

    2.4 緩沖液pH值對單糖衍生物分離度的影響

    色譜柱使用一段時間后,柱效降低,流動相比例為pH6.7的磷酸緩沖液 ∶乙腈=82∶18時,鼠李糖與半乳糖醛酸的分離度R下降,不能完全分離.在保持流動相比例不變的條件下,降低緩沖液pH,八種單糖衍生物的分離效果如圖3.

    表3 流動相比例對色譜峰分離度R的影響Tab.3 Effects of moblie phase ratio on seperation of peaks

    圖3 緩沖液pH值對色譜峰分離度的影響Fig.3 Effects of pH on seperation of peaks

    在本試驗(yàn)條件下,將磷酸緩沖液的pH從6.7降低到6.5,能顯著改善鼠李糖和葡萄糖醛酸衍生物的分離效果,達(dá)到完全分離,但同時樣品分離時間延長.兩種pH條件下,八種單糖衍生物的分離度R如表4,pH6.5條件下各色譜峰的分離度R幾乎均大于pH6.7.因此,降低磷酸緩沖液的pH,有助于提高色譜峰的分離效果.

    2.5 緩沖鹽濃度對色譜峰的影響

    分別使用鹽濃度為0.01、0.05、0.10mol/L的pH6.7磷酸鉀鹽緩沖液作為流動相A液,對葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖四種單糖衍生物進(jìn)行HPLC分析,比較不同緩沖鹽濃度對色譜峰不對稱因As的影響.結(jié)果如圖4和表5,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),緩沖鹽濃度越高,不對稱因子As越小,峰形越好.當(dāng)鹽濃度為0.01 mol/L時,色譜峰的不對稱因子As均高于1.4,明顯拖尾;當(dāng)鹽濃度為0.05mol/L時,色譜峰的不對稱因子As有所降低,色譜峰對稱性提高;當(dāng)鹽濃度為0.10mol/L時,色譜峰的不對稱因子As在1.05~1.2之間,對稱性較好.

    表4 緩沖液pH值對色譜峰分離度的影響Tab.4 Effects of pH on seperation of peaks

    圖4 不同緩沖鹽濃度下的色譜峰圖譜Fig.4 Effect of buffer concentration on asymmetry factor of peaks

    3 結(jié)論與討論

    本文研究了單糖衍生方法的中和、萃取過程對單糖-PMP衍生物的影響以及流動相對HPLC色譜峰的影響,結(jié)果表明:

    1)衍生結(jié)束后使用HCl完全中和,可以避免單糖-PMP衍生產(chǎn)物的損失.

    可能是由于單糖-PMP衍生物含有堿性基團(tuán),易在堿性條件下隨三氯甲烷萃取損失,而在酸性的環(huán)境中不穩(wěn)定,其原因需進(jìn)一步研究確認(rèn).

    2)使用三氯甲烷萃取PMP時,萃取多次可以顯著降低PMP的殘留,但在中性條件下萃取,仍然會造成單糖-PMP衍生產(chǎn)物的損失.選擇萃取3次,能較好平衡PMP去除和衍生產(chǎn)物保留的關(guān)系.

    3)降低流動相中有機(jī)相的比例或降低緩沖液的pH值,均能提高單糖衍生物色譜峰的分離效果;提高緩沖鹽濃度,能改善色譜峰的峰形,防止拖尾.

    使用磷酸緩沖液作為無機(jī)相時,為保持峰形對稱,需要較高的鹽濃度,而高濃度的鹽溶液對液相色譜系統(tǒng)和色譜柱均不利,有研究表明使用低濃度的乙酸銨鹽溶液也能得到對稱性好的色譜峰[15-17],因此,應(yīng)考慮使用乙酸銨鹽或?qū)ふ移渌木彌_體系替代磷酸緩沖鹽.實(shí)驗(yàn)中樣品不同濃度會影響色譜圖響應(yīng)值.

    表5 不同緩沖鹽濃度下的色譜峰不對稱因子AsTab.5 Effects of buffer concentration on asymmetry factor of peaks

    [1]柳志宇.瑪咖多糖提取及其單糖組成的研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2012.

    [2]唐策.黃連多糖的提取方法、單糖組成及其抑制α-葡萄糖苷酶活性研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2013.

    [3]美合日阿依·伊薩克,馬虎,周文婷,等.維藥榅桲多糖抗血栓作用及其機(jī)制研究[J].中國藥理學(xué)通報,2015,31(2):295-296.

    [4]李慧文,韓春姬,洪喜道,等.紅參多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報,2012,34(4):330-333+343.

    [5]王蓉,吳劍波.多糖生物活性的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊,2001,22(3):97-100.

    [6]陳克克.地瓜兒多糖的單糖組成實(shí)驗(yàn)中兩種流動相的比較研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,5(5):41-45+49.

    [7]Honda S,Akao E,Su-uzki S,et al.High-performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly uitraviolet-absorbing and electro?chemically sensitive 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives[J].Analytical Biochemistry,1989,180:351-357.

    [8]Honda S,Togashi K,Taga A.Unusual separation of l-phenyl-3-mehtyl-5-pyrazolone derivatives of aldoses by capillary zone electrophoresis[J].J ChormatogrA,1997,791:307-311.

    [9]Honda S,Suuzki S,Taga A.Analysis of carbohydrates as l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives by capillary/microchip electrophoresis and capillary electrochromatography[J].J.Pharm.Biomed.Anal.2003,30:1689-1714.

    [10]楊興斌,趙燕,周四元,等.柱前衍生化高效液相色譜法分析當(dāng)歸多糖的單糖組成[J].分析化學(xué),2005,33(9):1287-1290.

    [11]Lv Y,Yang XB,Zhao Y,et al.Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyl?lum by HPLC with indirect UV detection[J].Food Chemistry,2009,112(3):742-746.

    [12]張萍.1,3取代吡唑啉酮類試劑的合成及其用于糖類物質(zhì)的衍生化和分析研究[D].西安:西北大學(xué),2011.

    [13]C.B.Castells,V.C.Arias,R.C.Castells.Precolumn derivatization of reducing carbohydrates with 4-(3-methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl)benzoic acid.Study of reaction,high-performance liquid chromatographic separation and quantitative performance of method[J].Chromatographia,2002,56(8):153-160.

    [14]戴軍,朱松,湯堅,等.PMP柱前衍生高效液相色譜法分析杜氏鹽藻多糖的單糖組成[J].分析測試學(xué)報,2007,26(2):206-210.

    [15]STRYDOM D.J.Chromatographic separation of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone-derivatized neutra,l acidic and basic aldo-ses[J].J Chroma?togr A,1994,678:17-23.

    [16]任浩娜,陳曉輝,畢開順,等.柱前衍生化HPLC法分析沙參多糖中單糖組成[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2009,26(3):206-209.

    [17]林雪,賈敬芬,黃琳娟,等.RP-HPLC用于蘆薈多糖的單糖組成研究[J].食品科學(xué),2006,27(4):192-195.

    責(zé)任編輯:高 山

    Research on the Method of PMP Pre-column Derivation of Monosaccharides by HPLC

    ZHU Zhaowu1,2,ZHUANG Yang1,2,XIANG Chunlin1,2,ZHAO Na2,LI Shan1,2,XIANG Lingfang1,2,MO Kaiju1,2?
    (1.School of Biological Science and Technology,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China;2.Key Laboratory of Biologic Resources and Utilization of Hubei Province(Hubei University for Nationalities),Enshi 445000,China)

    This article discussed the impact of PMP pre-column derivation on monosaccharide derivatives from extraction pH and extraction times.Moreover,the influence of mobile phase on the HPLC chromato?graphic peaks also have been studied from the ratio of mobile phase,the pH of buffer and the concentra?tion of buffer.The results indicated:Neutralized the derivation liquid with HCl to pH7.0 could avoid the loss of derivatives products to the utmost.Extracting three times by chloroform could remove almost PMP and avoid the loss of derivatives.Reducing the ratio of organic phase or the pH of buffer could improve the seperation of peaks;the asymmetry factor of peaks could be maintained in the optimum range by increas?ing the concentration of buffer.

    monosaccharides;PMP derivatives;HPLC;seperation;asymmetry factor

    O657.72

    A

    1008-8423(2015)03-0337-05

    10.13501/j.cnki.42-1569/n.2015.09.027

    2015-05-19.

    湖北省研究與開發(fā)計劃項目(2010BBB016).

    朱照武(1989-),女,碩士生,主要從事林特食品加工與開發(fā)研究;?

    莫開菊(1965-),女,博士,教授,主要從事食品加工及天然產(chǎn)物化學(xué)的研究.

    猜你喜歡
    醛酸三氯甲烷單糖
    曝氣吹脫及氣洗炭池對水廠三氯甲烷的控制
    澳新擬批準(zhǔn)來自轉(zhuǎn)基因米曲霉的多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶作為加工助劑
    頂空氣相色譜法測定水中三氯甲烷含量的穩(wěn)定性研究
    指甲油致癌?符合標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品可放心用
    葡萄糖醛酸內(nèi)酯制備和表征研究
    三氯甲烷市場價格持續(xù)走高
    海藻多糖的單糖組成對體外抗氧化活性的影響
    基于Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)磷光內(nèi)濾效應(yīng)檢測β—葡萄糖醛酸酶
    蹄葉槖吾葉多糖提取工藝優(yōu)化及單糖組成研究
    HPLC-ELSD法測定煙草中單糖含量
    激情在线观看视频在线高清 | 成人影院久久| 精品久久久精品久久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜久久久在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 99精品久久久久人妻精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 午夜免费观看网址| 久久性视频一级片| 自线自在国产av| 久久 成人 亚洲| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产一区二区激情短视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 99在线人妻在线中文字幕 | 精品久久久久久,| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美久久黑人一区二区| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲一码二码三码区别大吗| 男女床上黄色一级片免费看| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜老司机福利片| 亚洲第一av免费看| 成人影院久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美乱色亚洲激情| 美女高潮到喷水免费观看| 怎么达到女性高潮| 亚洲av成人一区二区三| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 99香蕉大伊视频| av中文乱码字幕在线| www.熟女人妻精品国产| 免费不卡黄色视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 男人操女人黄网站| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 三上悠亚av全集在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 很黄的视频免费| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲成人免费av在线播放| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 在线视频色国产色| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产午夜精品论理片| 天堂网av新在线| 女警被强在线播放| 岛国视频午夜一区免费看| 99国产综合亚洲精品| 久久人妻av系列| 99久久无色码亚洲精品果冻| 九九热线精品视视频播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久这里只有精品中国| 美女黄网站色视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲av免费在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品一区二区三区四区久久| 99久久九九国产精品国产免费| 日本在线视频免费播放| 亚洲av不卡在线观看| а√天堂www在线а√下载| 婷婷亚洲欧美| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲在线自拍视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲不卡免费看| 观看免费一级毛片| 午夜视频国产福利| 午夜日韩欧美国产| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美日韩福利视频一区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 高清日韩中文字幕在线| 久久久久久久久大av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲专区国产一区二区| 国产亚洲精品av在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99久久精品热视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | ponron亚洲| 国模一区二区三区四区视频| 久久精品综合一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产| www日本黄色视频网| 国产不卡一卡二| 国内揄拍国产精品人妻在线| 色吧在线观看| 亚洲无线在线观看| 欧美一区二区亚洲| 国产高清视频在线播放一区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品国产高清国产av| 婷婷精品国产亚洲av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产一区二区三区视频了| 久久久久久久久大av| 1000部很黄的大片| 午夜视频国产福利| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 两人在一起打扑克的视频| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲七黄色美女视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 最近在线观看免费完整版| 最近在线观看免费完整版| 真实男女啪啪啪动态图| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99国产精品一区二区三区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲精品成人久久久久久| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成年女人毛片免费观看观看9| 一级作爱视频免费观看| 午夜福利在线观看吧| 色精品久久人妻99蜜桃| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美zozozo另类| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产高潮美女av| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品国产高清国产av| 又黄又粗又硬又大视频| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲成人久久性| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜影院日韩av| 国语自产精品视频在线第100页| 伊人久久精品亚洲午夜| 全区人妻精品视频| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲成人久久性| 老汉色∧v一级毛片| 午夜福利高清视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 不卡一级毛片| 国产av在哪里看| 亚洲中文日韩欧美视频| 国内精品一区二区在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久久色成人| 国产高清有码在线观看视频| 午夜精品在线福利| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日韩高清综合在线| 国产黄a三级三级三级人| www日本黄色视频网| 我的老师免费观看完整版| 精品国产亚洲在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲真实伦在线观看| 在线观看一区二区三区| 国产一区二区在线观看日韩 | 精品国产三级普通话版| 久久精品影院6| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 五月伊人婷婷丁香| 国产主播在线观看一区二区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 色噜噜av男人的天堂激情| www.999成人在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 美女大奶头视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 成年免费大片在线观看| 国产成人欧美在线观看| 久久久色成人| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产成人aa在线观看| 国产成人aa在线观看| 精品日产1卡2卡| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜免费激情av| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品99久久久久久久久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 少妇人妻一区二区三区视频| 麻豆国产97在线/欧美| 久久亚洲真实| 欧美色视频一区免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 老汉色∧v一级毛片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 最新美女视频免费是黄的| 无限看片的www在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美性猛交黑人性爽| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 免费人成视频x8x8入口观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 成年版毛片免费区| 波多野结衣巨乳人妻| 精品国产亚洲在线| 亚洲中文字幕日韩| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美在线一区亚洲| av在线天堂中文字幕| 一个人观看的视频www高清免费观看| 深爱激情五月婷婷| 精品一区二区三区视频在线 | 乱人视频在线观看| 亚洲av熟女| 舔av片在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 男人舔奶头视频| 美女免费视频网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久久久久精品吃奶| 国模一区二区三区四区视频| 内地一区二区视频在线| 99精品久久久久人妻精品| or卡值多少钱| av在线蜜桃| 一a级毛片在线观看| 国产精品影院久久| 国内精品久久久久久久电影| 欧美一区二区国产精品久久精品| av视频在线观看入口| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久九九热精品免费| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费无遮挡裸体视频| 国产三级中文精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久国产精品麻豆| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| av专区在线播放| 国产99白浆流出| 男人舔女人下体高潮全视频| a级毛片a级免费在线| 久9热在线精品视频| 国产高清三级在线| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 欧美成人性av电影在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99热这里只有是精品50| 日本一本二区三区精品| 日韩欧美在线乱码| 无限看片的www在线观看| 特级一级黄色大片| 国产爱豆传媒在线观看| 一a级毛片在线观看| av欧美777| 亚洲av免费在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 欧美成人a在线观看| 国产真实乱freesex| xxx96com| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 老汉色av国产亚洲站长工具| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 无限看片的www在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 国产高清视频在线观看网站| 在线观看午夜福利视频| 欧美日韩一级在线毛片| 18+在线观看网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产成人福利小说| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲熟妇熟女久久| 国产高清有码在线观看视频| 可以在线观看的亚洲视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久久久久久中文| 日本黄大片高清| 91av网一区二区| 我要搜黄色片| 国产淫片久久久久久久久 | 国产一区二区在线观看日韩 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品永久免费网站| 国产单亲对白刺激| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产成人a区在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 综合色av麻豆| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美三级亚洲精品| 天堂动漫精品| 日本a在线网址| 久久草成人影院| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产三级在线视频| 日韩欧美免费精品| 少妇的丰满在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 91av网一区二区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美中文日本在线观看视频| 99热精品在线国产| av福利片在线观看| 午夜视频国产福利| 国内精品一区二区在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 日本 av在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 超碰av人人做人人爽久久 | 在线观看免费午夜福利视频| 天堂网av新在线| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黄色片一级片一级黄色片| 日韩欧美在线乱码| www日本黄色视频网| 国产精品久久视频播放| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲国产精品999在线| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品亚洲av一区麻豆| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美+日韩+精品| 一区福利在线观看| 特级一级黄色大片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 色综合站精品国产| 一夜夜www| 免费在线观看成人毛片| 一级毛片高清免费大全| 我的老师免费观看完整版| 天堂√8在线中文| 美女cb高潮喷水在线观看| 中文字幕久久专区| 亚洲精品在线美女| 成年女人永久免费观看视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美大码av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲av熟女| e午夜精品久久久久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久人人精品亚洲av| 51午夜福利影视在线观看| 九色国产91popny在线| 国产爱豆传媒在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲av熟女| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲中文字幕日韩| 丰满乱子伦码专区| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| svipshipincom国产片| 精品国产亚洲在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| e午夜精品久久久久久久| 在线a可以看的网站| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久久久久人人人人人| 国产精品精品国产色婷婷| 国产淫片久久久久久久久 | 嫩草影院入口| 99热这里只有是精品50| 日本免费一区二区三区高清不卡| 叶爱在线成人免费视频播放| 色av中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 国产高清有码在线观看视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 精品电影一区二区在线| 在线天堂最新版资源| 十八禁网站免费在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 少妇的逼水好多| 欧美在线黄色| 欧美乱妇无乱码| 一夜夜www| 最新在线观看一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 嫩草影院精品99| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 免费高清视频大片| 桃色一区二区三区在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 啦啦啦免费观看视频1| 18禁美女被吸乳视频| 国产精品久久久久久久久免 | 乱人视频在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产精品永久免费网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产成人福利小说| 亚洲av美国av| 少妇丰满av| 嫁个100分男人电影在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 午夜福利高清视频| 一个人免费在线观看电影| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 无遮挡黄片免费观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 九色成人免费人妻av| 亚洲人成网站在线播| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美中文综合在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 宅男免费午夜| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美+日韩+精品| 国产中年淑女户外野战色| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲成av人片在线播放无| 国产成人av激情在线播放| 女警被强在线播放| 桃色一区二区三区在线观看| 国产综合懂色| 男女下面进入的视频免费午夜| 一进一出抽搐动态| 在线观看av片永久免费下载| 午夜亚洲福利在线播放| 国产色爽女视频免费观看| 91av网一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| www日本在线高清视频| 有码 亚洲区| 午夜久久久久精精品| 欧美又色又爽又黄视频| 久久久久九九精品影院| 午夜日韩欧美国产| 精品国产美女av久久久久小说| aaaaa片日本免费| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 69人妻影院| 99热精品在线国产| 日本五十路高清| 波多野结衣高清无吗| 亚洲,欧美精品.| xxxwww97欧美| 一个人看视频在线观看www免费 | 日本在线视频免费播放| 熟女电影av网| 超碰av人人做人人爽久久 | 黄色日韩在线| 嫩草影院精品99| 国语自产精品视频在线第100页| 一个人免费在线观看电影| 国产精品99久久久久久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 精品国产美女av久久久久小说| 中出人妻视频一区二区| 最好的美女福利视频网| 少妇人妻精品综合一区二区 | 成人18禁在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 性色avwww在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲第一电影网av| 99久久精品热视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美一级a爱片免费观看看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 69人妻影院| 成人永久免费在线观看视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 黄色片一级片一级黄色片| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲五月天丁香| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产成年人精品一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 久久久色成人| 国产视频一区二区在线看| 最近最新免费中文字幕在线| 伊人久久精品亚洲午夜| 九色成人免费人妻av| 日本在线视频免费播放| 亚洲美女黄片视频| 99在线视频只有这里精品首页| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产伦在线观看视频一区| or卡值多少钱| xxx96com| 亚洲片人在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 91久久精品电影网| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲在线观看片| 18禁国产床啪视频网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美+日韩+精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 午夜日韩欧美国产| 麻豆国产97在线/欧美| 三级毛片av免费| 国产亚洲欧美98| 特级一级黄色大片| 黄色视频,在线免费观看| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久久久九九精品二区国产| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产乱人伦免费视频| 欧美性感艳星| 亚洲国产欧美网| 成人特级av手机在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产成人福利小说| 日韩大尺度精品在线看网址| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩欧美三级三区| 日本三级黄在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 少妇的逼水好多| 一二三四社区在线视频社区8| 热99re8久久精品国产| 91字幕亚洲| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲电影在线观看av| 午夜亚洲福利在线播放| 国产午夜精品论理片| 偷拍熟女少妇极品色| 免费看光身美女| 搡老岳熟女国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品久久久久久,| 免费在线观看亚洲国产| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲av免费高清在线观看| 国内精品美女久久久久久| 熟女人妻精品中文字幕| 欧美又色又爽又黄视频| 国产成人av教育| 男女午夜视频在线观看| 在线看三级毛片| 啦啦啦免费观看视频1| 日韩欧美在线二视频| 丁香欧美五月| 国产69精品久久久久777片| 国产三级在线视频| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲美女黄片视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产探花极品一区二区| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 草草在线视频免费看| 色视频www国产| 亚洲一区二区三区色噜噜| 成年女人永久免费观看视频| 麻豆一二三区av精品| 美女黄网站色视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看av片永久免费下载|