綠膿桿菌耐藥性與外膜通透性聯(lián)系及對新藥篩選的影響

劉曉榮 翟俊偉

綠膿桿菌耐藥性與外膜通透性聯(lián)系及對新藥篩選的影響

劉曉榮 翟俊偉

目的:針對綠膿桿菌進(jìn)行研究，主要通過對其外膜通透性的實(shí)驗(yàn)了解其對不同抗生素的耐藥性，從而為藥物選用提供幫助。方法選取不同種類藥物并制備好不同酸堿值以及濃度的溶液，培養(yǎng)菌體細(xì)胞并分離外膜、制備外膜蛋白、微孔蛋白處理、電泳處理與磷脂預(yù)處理、重建蛋白脂質(zhì)體。結(jié)果確定了綠膿桿菌外膜微孔蛋白的分離以及純化方面的嚴(yán)格步驟，證實(shí)了一些孔道形成蛋白。同時測定了幾種抗生素對于綠膿桿菌外膜的通透作用。結(jié)論綠膿桿菌對多種抗生素的固有耐藥性是多重外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和有效通透屏障相結(jié)合的結(jié)果，因此在新藥物的篩選方面，應(yīng)研制克服這一耐藥機(jī)制的新化合物。

綠膿桿菌;外膜通透性;藥物作用

綠膿桿菌感染是當(dāng)前臨床上難以控制的疾病之一。臨床上出現(xiàn)的數(shù)量不斷增多的耐藥菌株迫使我們在重新設(shè)計藥物時應(yīng)考慮其更廣泛的耐藥機(jī)制，也就是生物膜屏障與主動轉(zhuǎn)運(yùn)阻止藥物到達(dá)其作用靶位。綠膿桿菌對多種結(jié)構(gòu)不同的抗生素耐藥，可以認(rèn)為綠膿桿菌的耐藥性與外膜通透性有關(guān)。外膜對抗生素的通透性大小直接影響到抗生素對細(xì)菌的作用，因此建立克服這一耐藥機(jī)制的藥物篩選模型、用于篩選新的抗綠膿桿菌化合物具有極高研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料本次研究中的綠膿桿菌菌株為購買所得，可保障菌株的標(biāo)準(zhǔn)性。培養(yǎng)基方面，采用的是LB培養(yǎng)基，其中包含了蒸餾水、氯化鎂、濃度為0.5%的氯化鈉、0.5%的酵母浸膏粉以及1%的胰蛋白胨。將上述材料充分混合后制備成培養(yǎng)基。

1.1.1 藥品準(zhǔn)備:藥品準(zhǔn)備方面，由于研究是針對綠膿桿菌的耐藥性，因此研究使用的藥品種類較多，如下:上海麗珠東風(fēng)制定的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、北京天象人生物公司生產(chǎn)的脫氧核糖酸酶以及同公司生產(chǎn)的十二烷基肌氨酸鈉、Sigma公司生產(chǎn)的水蘇四糖、β-辛基葡萄糖苷、雙十六烷磷酸鹽以及磷脂洗膽堿、Bio-Rad公司生產(chǎn)的Bio-Beads SM-2、本院保存的抗生素樣品妥布拉霉素以及慶大霉素、中國藥品生物制品檢定所提供的哌拉西林、頭孢克羅、頭孢氨芐、美國施貴寶公司生產(chǎn)的氨曲南、英國格蘭素公司生產(chǎn)的頭孢他啶、大連輝瑞公司生產(chǎn)的頭孢哌酮以及美國默沙東公司生產(chǎn)的亞胺培南。

1.1.2 配制溶液準(zhǔn)備［1－3］:溶液中蔗糖含量為20%，每升含有2 mol蔗糖，每升含有0.1 mol緩沖液(緩沖液的酸堿值為7.8)，濃度為1%的Na-EDTA溶液(酸堿值為7.8)，每升含有10 mmol磷酸鈉緩沖液(酸堿值為7.0)，每升含有10 mmol的磷酸鈉緩沖液(酸堿值為7.2，其中還含有1%的十二烷基肌氨酸鈉)，濃度為10%的SDS溶液、每升1.0 mol的Tris緩沖液(酸堿值為6.8)，每升1.5 mol的Tris緩沖液(酸堿值為8.8)。

制備SDS凝膠加樣緩沖液:選取10%甘油、0.1%溴酚藍(lán)、2%SDS、5%β硫基乙醇以及每升0.05 mol的Tris緩沖液(酸堿值為6.8)。制備Tris-HCl緩沖液:包含每升5 mmol的EDTA以及每升34 mmol的β-辛基葡萄糖苷，制備成酸堿值為8.0、每升10 mmol的緩沖液。制備貯備液:取1%N亞甲雙丙烯酰胺以及29%的丙烯酰胺，制備成濃度為30%的丙烯酰胺貯備液。

制備三種研究用緩沖液:A緩沖液——取每升1 mmol EDTA以及每升2.5 mmol的β-C12E8制備成酸堿值為8.0、每升含10 mmol的Tris-HCl緩沖液。B緩沖液——取每升1 mmol EDTA以及每升34 mmol的辛基葡萄糖苷制備成酸堿值為8.0、每升含10 mmol 的Tris-HCl緩沖液。C緩沖液——取每升1 mmol的氯化鎂(MgCl2)以及每升34 mmol的β-C12E8制備成酸堿值為8.0、每升含10 mmol的Tris-HCl緩沖液。

制備MOPS緩沖液:酸堿值為7.2，每升1 mmol;制備NAD緩沖液，酸堿值6.0，每升1 mmol;制備HCl緩沖液，酸堿值7.5，其中含有5%的DexrtanT-40，每升5 mmol。

1.1.3儀器準(zhǔn)備:由于本次研究是對綠膿桿菌進(jìn)行耐藥性以及成分等方面的研究，因此涉及到的儀器較多，包含有檢測設(shè)備、離心設(shè)備、干燥設(shè)備、色譜設(shè)備等，具體應(yīng)用設(shè)備種類如下:日本日立公司生產(chǎn)的紫外分光光度計、高速離心機(jī)以及超速離心機(jī);美國PerkinEnlier公司生產(chǎn)的二極管陣列檢測器以及高壓液相色譜儀;美國Cole Parmer公司生產(chǎn)的超聲粉碎儀;背景科普儀器廠生產(chǎn)的電泳儀;背景醫(yī)療設(shè)備廠提供的小型三用水箱、Wesco公司生產(chǎn)的滲透壓計(本次研究選擇的是5100B型號);Edwards公司生產(chǎn)的冷凍干燥機(jī)。研究中的系統(tǒng)使用的是微機(jī)實(shí)時處理系統(tǒng)，由Apple公司提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)菌體細(xì)胞并分離外膜:①菌體細(xì)胞的培養(yǎng):將已經(jīng)貯備好的綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，25 ml)中，將其靜置放在37℃環(huán)境中，隔夜之后采用已經(jīng)預(yù)熱處理的LB培養(yǎng)基稀釋，稀釋到250 ml之后再次放置在37℃環(huán)境中進(jìn)行通氣培養(yǎng)，時間4 h即可，期間每分鐘200 r，這樣能夠保障得到菌液生長狀態(tài)較好［4］。②分離外膜:在室溫下對期細(xì)胞進(jìn)行時間為8 min，轉(zhuǎn)速為每分鐘8 000 r的離心處理之后，在濃度為20%的蔗糖(此處劑量選為18 ml)中加入大約1.5 g濕菌體，使之懸浮于溶液中。讓溶液處于冰浴狀態(tài)，將濃度為0.5%的溶菌酶(劑量10 ml)、濃度為1%的NA-EDTA(酸堿值為7.8、劑量為0.8 ml)以及濃度為每升0.1 mol的Tris-HCl緩沖液(酸堿值為7.8、劑量為10 ml)緩慢的加入到溶液中［5］。

將上述操作中得到的混合物放置10 min，之后加熱使其溫度達(dá)到30℃，之后保溫處理1 h，期間在30 min時應(yīng)按照每毫升3 μg的劑量加入脫氧核糖酸酶。到時間后按照每分鐘12 000 r的速度離心處理約15 min，當(dāng)清液出現(xiàn)之后再按照每分鐘30 000 r的速度離心處理1 h。將粗制的外膜回收，并將外膜放入蒸餾水中使之懸浮，放置于4℃環(huán)境中透析［6］。

1.2.2 制備外膜蛋白:將粗制外膜在磷酸鈉緩沖液中懸浮(緩沖液酸堿值7.0、濃度為每升10 mmol，共取5 ml)，將0.5 ml濃度為2%的十二烷基肌氨酸鈉溶液緩慢倒入，將混合液放置在常溫下20 min是其融合。之后將其放在10℃環(huán)境中離心60 min，將產(chǎn)生的沉淀物重新加入到磷酸鈉緩沖液中(酸堿值為7.2、其中含有1%的十二烷基肌氨酸鈉，共200 μl)使之懸浮，同樣在室溫下放置20 min，之后在10℃環(huán)境中離心處理60 min。之后將產(chǎn)生的沉淀物(沉淀物中包含了外膜蛋白)在蒸餾水中懸浮，在4℃環(huán)境下透析處理之后放在零下70℃中保存?zhèn)溆茫?，8］。

1.2.3 微孔蛋白處理:對于微孔蛋白的處理，主要自傲與分離以及純化兩方面。首先取大約10高蛋白，將其外膜取下，加入到Tris-HCl緩沖液(酸堿值為8.0、劑量為5 ml、濃度為每升10 mmol)中，緩沖液中需含有每升5 mmol的EDTA以及每升34 mmol的β-辛基葡萄糖苷。將其充分混合之后放在超聲粉碎儀中，超聲處理2 min之后，采用離心處理，在20℃環(huán)境中處理0.5 h，將混合液中得到的上清液利用DEAE離子將高壓液相色譜柱交換。得到的色譜柱首先通過A緩沖液來平衡，使用濃度在每升0～0.5 mol的氯化鈉溶液中實(shí)施梯度洗脫，流速保持在每分鐘1 ml。檢測吸收度，采用紫外檢測器，對280 nm處展開檢測，將A、B、C 3組的高峰值記錄下來。放置在4℃環(huán)境中一晚之后，分析其蛋白，采用PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳法)分析［9］。

將B組分超濾進(jìn)行濃縮，完成后通過B緩沖液使之平衡，將得到的DEAE例子交換高壓液相色譜柱，使用濃度在每升0～0.5 mol的氯化鈉溶液中實(shí)施梯度洗脫，吸收度的檢測同樣設(shè)定在280 nm處，將峰組分收集記錄;放置在4℃環(huán)境中一晚之后，分析其蛋白。將實(shí)驗(yàn)得到的微孔蛋白干燥、冷凍處理，放置在零下70℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。分離純化流程圖如下。見圖1。

圖1 微孔蛋白分離純化流程圖

1.2.4 電泳處理與磷脂預(yù)處理:在實(shí)施電泳處理之前，應(yīng)將樣品放置在Tris-HCl緩沖液(酸堿值為6.8、濃度為每升0.05 mol)中，緩沖液中還應(yīng)包含有0.01%溴酚藍(lán)、2%SDS、5%β-硫基乙醇以及10%甘油。將其處于100℃環(huán)境中加入3 min，將積層膠以及分離膠中分別含有5%與10%的丙烯酰胺(比例調(diào)配方面，丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的摩爾比控制在29∶1)。凝膠上將電壓控制在每厘米8 V。觀察研究對象狀態(tài)，當(dāng)染料前端已經(jīng)進(jìn)入到分離膠內(nèi)部之后，應(yīng)適當(dāng)提升電壓，從之前的8 V提升至15 V，保持電泳處理，直到溴酚藍(lán)處于分離膠下部。達(dá)到之后，使用硝酸銀溶液(0.1%)實(shí)施染色，同時將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳。在分子量標(biāo)準(zhǔn)方面，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)需要采用97.4 kD磷酸化酶、31 kD碳酸酐酶、43 kD肌動蛋白、66.2 kD牛血清白蛋白、14.4 kD雞蛋清溶菌酶以及20.1 kD胰蛋白酶抑制劑［10］。

對磷脂的預(yù)處理方面，首先應(yīng)選取2.5 g磷脂膽堿，將其研磨直到成為細(xì)粉末狀態(tài)，將其加入到50 ml丙酮之中(其中含有每升2 mmol的硫基乙醇)。將其靜置在室溫下，抽提3 h，將丙酮抽提物丟棄，殘余物使用蒸餾水有效清洗，之后使用污水硫酸鈉將殘余物干燥處理，保存在零下70℃環(huán)境中備用。

1.2.5 重建蛋白脂質(zhì)體:將經(jīng)過預(yù)處理之后的磷脂酰膽堿取2.4 μmol，并取雙十六烷磷酸鹽0.2 μmol，將兩者同時加入到CHCl3中溶解。使用N2將試管底部干燥處理，完成后將其放入到真空干燥器中，時間定為2 h。取經(jīng)過適量純化之后的微孔蛋白以及脂類薄膜放入每升34 mmol的β-辛基葡萄糖苷100 μl中溶解，溶解后放在超聲儀中處理2 min。觀察懸浮液狀態(tài)，當(dāng)期處于透明狀時，可加入到Bio-Beads SM-2(150 mg)中，在室溫狀態(tài)下輕輕搖動約1 h，之后放在蒸餾水中，在4℃環(huán)境中透析24 h。將已經(jīng)重建的蛋白脂質(zhì)體放置在45℃水浴里面，使用N2將其干燥處理，時間為2 min;之后將試管放入真空干燥器中，時間至少為2 h。

2 結(jié)果

2.1 不同碳源生長情況研究統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)下不同碳源的生長情況，本次研究中主要研究了葡萄糖、果糖、蔗糖、肌醇、醋酸鈉、乳糖、檸檬酸鈉以及可溶性淀粉，具體生長情況。根據(jù)上表結(jié)果，可結(jié)合放線菌的鑒定分類標(biāo)準(zhǔn)以及鏈霉菌鑒定方法，鑒定菌株的流程，為外膜通透性研究提供幫助。見表1。

表1 碳源生長情況表

2.2 耐藥機(jī)制研究將不同菌株提取的β-內(nèi)酰胺酶對其他的β-內(nèi)酰胺抗生素水解率展開研究，了解綠膿桿菌對于不同藥物(磺芐青霉素、氨芐青霉素、亞胺培南、氨曲南、頭孢哌酮、頭孢他啶等)的水解率狀態(tài)，具體研究結(jié)果。見表2。

3 討論

在革蘭氏陰性菌中使用抗生素，首先應(yīng)建立一條通道，此通道由外膜蛋白形成，這樣藥物才能夠進(jìn)入到周漿的間隙之中。本次研究采用分離純化實(shí)驗(yàn)，將綠膿桿菌實(shí)施了外膜微孔蛋白處理，之后利用重建蛋白脂質(zhì)體，研究了抗生素對于微孔蛋白通透性的影響，也就是研究了其耐藥性。研究結(jié)果證明，采用的幾種試劑均具有通透功能。在對綠膿桿菌進(jìn)行外膜的分離制備時，傳統(tǒng)大多使用的是等密度梯度離心處理，這類型操作比較花費(fèi)時間。本次研究使用的則是十二烷基肌氨酸鈉，在試驗(yàn)時間上大大減少，同時所得結(jié)果與相關(guān)研究者的研究成果不謀而合，因此這種研究方式具有較高推廣價值。研究發(fā)現(xiàn)，在使用DEAE來進(jìn)行離子交換時，流動相使用鹽水體系，能夠讓蛋白在分離之后仍具有較高的微生物活性。在將β-辛基葡萄糖苷作為去垢劑加入之后，蛋白的溶解度可提升，讓柱承受的負(fù)載不會過于偏低，同時也可達(dá)到分離選擇性改善的效果［11］。

表2 綠膿桿菌對不同藥物水解率對比

通過研究，發(fā)現(xiàn)雖然氨曲南以及碳青霉素等單環(huán)β-內(nèi)酰胺類型的抗生素對于耐藥菌株產(chǎn)生的抑菌作用，但進(jìn)一步研究不難發(fā)現(xiàn)，研究中可能會受到β-內(nèi)酰胺抗生素的影響、干擾，可能讓研究出現(xiàn)假陽性狀態(tài)，影響研究準(zhǔn)確性。本次試驗(yàn)中得到了兩株符合要求的菌株，但要想了解其作用機(jī)制是否能夠有效應(yīng)用于外膜之上還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

碳青霉烯類(包括亞胺培能等在內(nèi))抗生素都是經(jīng)過擴(kuò)散途徑來對綠膿桿菌外膜進(jìn)行通過的，抗生素擴(kuò)散過程中，微孔蛋白的作用僅會表現(xiàn)于亞胺培能或其它碳青霉烯類抗生素，此時表現(xiàn)相對更為明顯。綠膿桿菌在外膜通透性方面若較輕，則其會更易選擇微孔蛋白孔道的狹窄部位?？股?如β-內(nèi)酞胺類、喳諾酮類、氯霉素類、四環(huán)素類)。一旦在細(xì)胞中產(chǎn)生了積累，并且積累到某一程度(臨界值)時，便會通過質(zhì)子梯度依賴性從系統(tǒng)泵中主動排出。換言之，綠膿桿菌對多種抗生素的固有耐藥性是多重外排轉(zhuǎn)運(yùn)體和有效通透屏障相結(jié)合的結(jié)果，因此在新藥物的篩選方面，應(yīng)研制克服這一耐藥機(jī)制的新化合物［12，13］。

總之，本次研究確定了綠膿桿菌外膜微孔蛋白的分離以及純化方面的嚴(yán)格步驟，證實(shí)了一些孔道形成蛋白。同時測定了幾種抗生素對于綠膿桿菌外膜的通透作用，也就研究了綠膿桿菌的耐藥性，通透效果越強(qiáng)，證明其耐藥性越弱，那么此類型抗生素的使用效果也就越佳。研究建立了通過外膜得出的抗綠膿桿菌篩選方式，通過外膜通透性了解藥物作用效果，為新藥的篩選提供了有效幫助。

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R 978.1

A

1002－7386(2015)03－0443－04

2014－06－11)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.049

063300河北省唐山市豐南區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科