抗綠膿桿菌活性物質(zhì)的篩選及有效成分研究

翟俊偉 劉曉榮

·論著·

抗綠膿桿菌活性物質(zhì)的篩選及有效成分研究

翟俊偉 劉曉榮

目的從眾多微生物中找到能夠?qū)咕G膿桿菌的活性物質(zhì)，分析其成分并分離鑒定，找到更有效的抗綠膿桿菌，為臨床醫(yī)學(xué)研究提供幫助。方法選取唐山市豐南區(qū)醫(yī)院花園土進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，通過各項(xiàng)研究篩選微生物，并對(duì)抗綠膿桿菌的活性成分表達(dá)條件不斷優(yōu)化，研究不同環(huán)境下酸堿值、培養(yǎng)基、時(shí)間以及溫度條件下比較其活性成分，從而得出適合的發(fā)酵條件。收集發(fā)酵液，采用離子交換、硫酸銨沉淀、分子篩等方式將蛋白純化。測(cè)定抗綠膿桿菌活性成分的敏感性、穩(wěn)定性、分子量等。結(jié)果從研究的土壤中篩選出了5種菌群，經(jīng)過革蘭氏染色、菌落形態(tài)、RDP序列分析等操作，分析了菌株的不動(dòng)細(xì)菌數(shù)以及假單胞菌屬。結(jié)論拮抗綠膿桿菌的活性成分分析研究顯示，活性成分不適宜在高溫下存活，且容易被蛋白酶K水解，分子量大約在35 kD左右，屬于抗菌蛋白。

綠膿桿菌;活性物質(zhì);表達(dá)條件;菌落形態(tài)，發(fā)酵

綠膿桿菌能產(chǎn)生多種致病物質(zhì)，主要是內(nèi)毒素、外毒素、蛋白分解酶和殺白組胞素等。其致病特點(diǎn)是引起繼發(fā)感染，多發(fā)生在機(jī)體抵抗力降低時(shí)，如大面積燒傷，長期使用免疫抑制劑等。臨床上常見的有皮膚和皮下組織感染，中耳炎、腦膜炎、呼吸道感染、尿道感染、敗血癥等［1，2］。應(yīng)用抗綠膿桿菌免疫力血清可降低患者繼發(fā)敗血癥的發(fā)生率和病死率［3］。因此研究對(duì)綠膿桿菌的抗體并分析其成分具有較高臨床意義。本次研究基于這一背景，采用實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)方式，從最初的試劑、設(shè)備準(zhǔn)備開始，針對(duì)抗綠膿桿菌活性物質(zhì)展開篩選并研究其成分，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑本次研究由于研究重點(diǎn)在于綠膿桿菌方面，因此應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作以及相關(guān)藥劑的設(shè)定，具體而言，可分為培養(yǎng)基的準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)菌種的培養(yǎng)、土壤樣品的選取、主要實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備以及實(shí)驗(yàn)需要儀器的安排等，具體如下:

1.1.1 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備［4-6］:培養(yǎng)基主要有發(fā)酵培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基兩種。發(fā)酵培養(yǎng)基的制備包含1 000 ml蒸餾水、5 g氯化鈉、3 g葡萄糖、5 g胰蛋白胨以及3 g酵母膏，將發(fā)酵培養(yǎng)基的酸堿值控制在7.2～7.4，制備完成后將培養(yǎng)基放在121℃的高溫環(huán)境中半小時(shí)來高壓、高溫滅菌。LB培養(yǎng)基的制備包含1 000 ml蒸餾水、10 g氯化鈉、5 g酵母膏以及10 g胰蛋白胨，同樣將制備好的培養(yǎng)基酸堿值調(diào)節(jié)到7.2～7.4，放在121℃的高壓、高溫環(huán)境中滅菌0.5 h。除上述兩種培養(yǎng)基外，還應(yīng)制備復(fù)篩培養(yǎng)基以及固體培養(yǎng)基。復(fù)篩培養(yǎng)基的制備主要是在蒸餾水中加入濃度為5%的氯化鈉溶液、2.5%的酵母膏以及5%的胰蛋白胨。固體培養(yǎng)基的制備方面，主要為抑菌作用并讓其處于相對(duì)黏稠狀態(tài)，因此在制備上需加入一定量的瓊脂，具體而言，需在蒸餾水中加入濃度為2.5%的氯化鈉溶液，1.3%的酵母膏以及2.5%的胰蛋白胨，同時(shí)將1%瓊脂加入其中。上述兩種培養(yǎng)基均將酸堿值調(diào)整至7.2～7.4，并放置在高溫高壓(121℃)環(huán)境中0.5 h，將制備中可能產(chǎn)生的細(xì)菌消滅。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌種的培養(yǎng):本次研究中實(shí)驗(yàn)菌種主要有兩種，即指示菌以及供試菌。指示菌為PA01，由醫(yī)院本身研究提供。供試菌為B2002、B2001、B1506、B1505、B1503.

1.1.3 土壤樣品的選取:研究中使用的土壤為正常土壤，主要取自我院花壇中土壤。取樣之后將土壤按照重量分類(保障土壤成分均勻，并且取自同一范圍)，有效編號(hào)。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備:實(shí)驗(yàn)試劑包含兩性電解質(zhì)、寬分子量蛋白以及試劑盒。其中試劑盒為上海華舜公司(生物技術(shù))生產(chǎn)，用于抽提注釋小量細(xì)菌的DNA基因組。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)需要儀器的安排:對(duì)綠膿桿菌的研究需要的儀器較多，涉及到滅菌、觀察、培養(yǎng)等各項(xiàng)操作，因此在儀器準(zhǔn)備方面如下:上海尤尼柯公司生產(chǎn)的紫外可見分光光度計(jì)、上海申安醫(yī)療公司生產(chǎn)的滅菌鍋、北京六一儀器公司生產(chǎn)的電泳儀、常規(guī)顯微鏡、冷凍離心機(jī)、常州國華公司生產(chǎn)的恒溫培養(yǎng)振蕩器、上海精宏實(shí)驗(yàn)公司生產(chǎn)的生化培養(yǎng)箱以及蘇州泰安空氣技術(shù)公司生產(chǎn)的潔凈工作臺(tái)。上述儀器為本次研究時(shí)使用到的主要儀器。

1.2 方法綠膿桿菌實(shí)驗(yàn)涉及到其耐藥性研究以及外膜通透性研究，因此在試驗(yàn)方法上首先應(yīng)進(jìn)行綠膿桿菌的篩選與培養(yǎng)，其次將其菌株進(jìn)行分離研究，之后鑒定其菌株?duì)顟B(tài)，便可開始對(duì)其活性成分的條件表達(dá)、成分純化以及成分特征展開研究。

1.2.1 拮抗綠膿桿菌的篩選與培養(yǎng):之前提到，土壤的選取是在我院花壇中選取，在土壤采集之后，需要將其放在4℃的環(huán)境中妥善保存，以免影響到培養(yǎng)效果。在拮抗綠膿桿菌的篩選方面，本次研究采用的是“雙層平板法”。首先制作下層部分，將出篩培養(yǎng)基與指示菌(研究中的指示菌為綠膿桿菌)混合均勻，使之成為下層培養(yǎng)基。上層部分的制作方面，首先應(yīng)將已經(jīng)妥善保存的土壤研磨充分，之后實(shí)施梯度稀釋，取土壤懸液1 ml倒入之前已經(jīng)做好的下層培養(yǎng)基上。制作完成后，需將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入(需注意此培養(yǎng)基倒入時(shí)的溫度需保持在50℃)，在充分混合后上層培養(yǎng)基制作完成。整體的培養(yǎng)基需要放置在保持37℃的環(huán)境中，同時(shí)做好日觀察記錄［7，8］。

1.2.2 拮抗綠膿桿菌的菌株分離:當(dāng)制備好的培養(yǎng)基上已經(jīng)產(chǎn)生菌落時(shí)，可用牙簽(經(jīng)過滅菌處理)將初篩雙層平板上已經(jīng)出現(xiàn)的透明圈菌落挑起部分，實(shí)施劃線分離操作。將單一菌落挑取出來，用點(diǎn)接方式將其放在驗(yàn)證版(含有綠膿桿菌)上面，并在37℃環(huán)境中靜置培養(yǎng)3 d。3 d后觀察驗(yàn)證版上是否已經(jīng)出現(xiàn)了透明圈，若出現(xiàn)則注意觀察產(chǎn)圈是否呈穩(wěn)定狀態(tài)。對(duì)于呈穩(wěn)定性的產(chǎn)圈，其菌株應(yīng)進(jìn)一步展開純化操作并妥善保存，以備后續(xù)試驗(yàn)研究。

1.2.2.1 抑菌活性測(cè)試［9，10］:①首先在直徑為100 mm的指示平板上將抑菌平板固體培養(yǎng)基(溫度為50℃，劑量為50 ml)加入，靜置存放直至其完全冷卻。冷卻之后將綠膿桿菌菌懸液(劑量為100 μl，濃度為OD600=0.2)均勻的涂抹在培養(yǎng)基上。②之后進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，本次研究采用的是打孔擴(kuò)散法。使用打孔器將指示平板上打孔，孔直徑約在9 mm左右。通過已經(jīng)打好的孔注入發(fā)酵上清液約300 μl，在37℃的恒溫下培育24 h。之后觀察打孔周邊抑菌圈狀態(tài)，主要觀察其大小，將透明圈的直徑測(cè)量并記錄。

1.2.2.2 菌株的重復(fù)篩選:首先應(yīng)將適合的菌株實(shí)施發(fā)酵，選取通過分離找出的帶有拮抗綠膿桿菌能力的菌株，將其采用搖瓶方式發(fā)酵。使用之前制備好的復(fù)篩培養(yǎng)基，將其接種于錐形瓶中(錐形瓶中裝液量控制在100 ml/250 ml)，接種量在0.01，將其放在37℃環(huán)境中，使用250 r/min搖振培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，每隔12 h需觀察發(fā)酵液狀態(tài)，8 000 r/min搖振離心10 min，將菌體去除。抑菌活性的測(cè)定采用打孔擴(kuò)散法，觀察菌體狀態(tài)以及透明圈直徑并嚴(yán)格記錄。菌株篩選方面，選取對(duì)綠膿桿菌存在抑菌作用的且抑菌圈相對(duì)較大的菌株。③之后排出發(fā)酵液中其他影響，主要為酸堿作用影響。在培養(yǎng)24 h之后，測(cè)定發(fā)酵液的酸堿值，并對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究前發(fā)酵液的酸堿值。實(shí)驗(yàn)前酸堿值已經(jīng)在培養(yǎng)基制備時(shí)保持在了7.2～7.4，因此若產(chǎn)生變化便可得出在發(fā)酵過程中菌株是否會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸或是有機(jī)減。④最后實(shí)施蛋白酶的處理。將蛋白酶K配置成為溶液狀態(tài)，比例為每毫升含5 mg。在ep管中放入0.1 ml蛋白酶K溶液，同時(shí)將0.4 ml發(fā)酵液放入其中，讓其最終濃度保持在1 mg/ml。將溶液酸堿值調(diào)節(jié)到7.0左右。與此同時(shí)，需要在0.4 ml發(fā)酵液中加入0.1 ml的雙蒸水，以此作為對(duì)照研究。將2組處理放在37℃環(huán)境中0.5 h，觀察發(fā)酵上清液在抑菌活性上的變化，并將抑菌圈出現(xiàn)縮小趨勢(shì)的菌株篩選出來備用。

1.2.3 菌株的鑒定:首先對(duì)拮抗綠膿桿菌實(shí)施形態(tài)學(xué)鑒定。選取已經(jīng)培養(yǎng)了24 h以上的菌株，采用革蘭氏染色法，利用顯微鏡觀察菌體狀態(tài)，包含形狀以及顏色等基本方面。將選取的菌株劃線培養(yǎng)(在營養(yǎng)瓊脂平板上面)，之后觀察菌落變化情況。DNA染色體的提取:首先選取1 ml細(xì)菌培養(yǎng)液，采用12 000 r/min離心1 min，之后盡可能將上清部分吸盡，以免影響到研究準(zhǔn)確性。想襯墊的細(xì)菌中加進(jìn)溶液A 200 μl，充分振蕩，讓菌體保持在充分懸浮狀態(tài)，將每毫升200 μl的RNaseA選取200 μl加入，保持在37℃的環(huán)境中靜置30 min。將每毫升10 mg的蛋白酶K 20 μl加入到管中，充分混合之后靜置在55℃環(huán)境中1 h，期間應(yīng)將試管顛倒數(shù)次保障樣品消化完全，也就是液體變得黏稠、清亮。將溶液B加入試管中200 μl，充分混合之后至溶液清亮。在管中加入無水乙醇200 μl，混合均勻之后觀察試管，此時(shí)可能存在絮狀物的沉淀，屬于正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響DNA提取，處理上可將沉淀物與溶液均加入吸附柱，靜置2 min。選取12 000 r/min離心1 min，加入漂洗液500～700 μl，將廢棄液丟掉之后將吸附柱放入收集管。

2 結(jié)果

2.1 拮抗綠膿桿菌分離菌形態(tài)研究根據(jù)本次研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，不同菌株在特征上不盡相同，本次研究共研究了5種菌株，大部分為短桿菌，只有編號(hào)為B1506的菌株為桿菌。菌體直徑方面，B1506的菌株直徑最小，B2002菌體直徑最大。見表1。

2.2 RDP研究本次研究測(cè)定了5種菌株的同源性、相似度最高菌株以及RDB分析，結(jié)果顯示，B1506菌株同源性達(dá)到了100%，其余4種同源性為99%。且B1506與B1505為不動(dòng)桿菌屬，其余3項(xiàng)為假單胞菌屬。見表2。

表1 菌體形態(tài)研究表

表2 RDP測(cè)定結(jié)果表

3 討論

綠膿桿菌能產(chǎn)生多種與毒力有關(guān)的物質(zhì)，如內(nèi)毒素、外毒素a、彈性蛋白酶、膠原酶、胰肽酶等，其中以外毒素a最為重要。外毒素a機(jī)制與白喉毒素有些類似，即最終使核糖體上延長因子2(ef～2)失活，抑制宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，但具體過程不同。此外，外毒素a和白喉毒素在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、免疫原性、鞭細(xì)胞和敏感動(dòng)物等方面均有差異［11］。

3.1 活性物質(zhì)篩選通過本次研究，了解到抗綠膿桿菌在活性物質(zhì)篩選方面，土壤是微生物發(fā)育、成長的必須環(huán)境，此處微生物種類繁多，且較為集中，數(shù)量也比較大，因此土壤可以說是具有豐富菌種的微生物資源庫，對(duì)于拮抗綠膿桿菌的篩選可能性較大。研究選擇的瓊脂擴(kuò)散法操作上較為簡單，將抑菌物質(zhì)涂抹在指示板上，經(jīng)過時(shí)間以及溫度影響讓其擴(kuò)散后會(huì)形成抑菌區(qū)域，此區(qū)域濃度較穩(wěn)定，對(duì)微生物生長起到抑制作用并呈現(xiàn)出透明狀，抑菌圈的大小能夠起到判斷抑菌物質(zhì)效果、強(qiáng)弱的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在確定發(fā)酵成分為抗菌蛋白或是抗菌肽之前，應(yīng)將發(fā)酵液中的堿成分以及酸成分排除，減少其對(duì)綠膿桿菌的影響。對(duì)酸堿值的測(cè)定加上蛋白酶處理能夠確定最后分離物質(zhì)是蛋白類還是肽類。

3.2 鑒定菌種本次研究由于條件限制，在DNA雜交試驗(yàn)方面存在限制條件，因此是結(jié)合了序列分析來研究菌株形態(tài)的。鑒定結(jié)果顯示，B1506與B1505為不動(dòng)桿菌屬，其余三項(xiàng)均屬于假單胞桿菌。其中由于B1505的細(xì)胞壁相對(duì)于其他幾種而言較厚，因此采用常規(guī)方式破壁并不能有有效將其細(xì)胞壁破壞，因此在基因組的提取方面難度相對(duì)較大，研究采用的是溶菌酶處理方式，在36 h之后將其溶解。由此可見，這類型細(xì)胞壁組織具有與其他4種不同的特殊性。且后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，其同源性達(dá)到了99%，很可能成為一種新的菌株。

3.3 發(fā)酵條件研究中使用的培養(yǎng)基初始酸堿值在7.2～7.4，這對(duì)抗菌肽的影響比較大，菌株不同，其成長需要的酸堿環(huán)境也不盡相同。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基起始pH值對(duì)抗菌肽的也很大，在初始酸堿為7.0～8.0時(shí)，B1505發(fā)酵液的抑菌活性較高，而其他酸堿值下抑菌活性明顯降低，說明培養(yǎng)基的初始酸堿值在發(fā)酵過程中對(duì)抗菌肽的產(chǎn)生具有重要作用。剛從普通土壤中分離得到的B1505發(fā)酵產(chǎn)量相對(duì)偏低，菌種生長較為緩慢，原因方面:(1)可能是自然條件下(普通土壤)相關(guān)基因表達(dá)量低，(2)培養(yǎng)條件也是影響發(fā)酵的重要因素。為了提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，我們對(duì)其進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)。培養(yǎng)基是進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化的重要方面，不同的微生物生長及發(fā)酵過程需要的培養(yǎng)基不同，且培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響是至關(guān)重要的。由于采用小試搖瓶培養(yǎng)，重要目的是發(fā)現(xiàn)并純化發(fā)酵產(chǎn)物，所以產(chǎn)量相對(duì)較高足以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)［12］。

綜上所述，本次研究中針對(duì)5種菌株展開研究，經(jīng)過革蘭氏染色、DNA提取等操作研究了菌落形態(tài)等，將其分為了不動(dòng)桿菌屬以及假單胞菌屬。研究表明，抗綠膿桿菌的活性成分不易存放在高溫環(huán)境中，易被蛋白酶K水解，是一種抗菌蛋白。

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1002-7386(2015)02-0206-03

2014-10-22)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．015

063300河北省唐山市豐南區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科