基于彌散圓的光學(xué)顯微鏡景深自動(dòng)標(biāo)定方法

崔 力，李長陽

（寧波大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 寧波 315211）

基于彌散圓的光學(xué)顯微鏡景深自動(dòng)標(biāo)定方法

崔 力，李長陽

（寧波大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 寧波 315211）

針對光學(xué)顯微鏡存在小景深且景深范圍不易確定的缺陷，導(dǎo)致后續(xù)圖像處理工作困難這一問題，提出了一種基于彌散圓的光學(xué)顯微鏡景深自動(dòng)標(biāo)定方法?？刂撇竭M(jìn)電機(jī)z軸方向移動(dòng)連續(xù)拍攝，保證載物臺上圓點(diǎn)標(biāo)定板從前離焦到后離焦定向移動(dòng)；利用活動(dòng)輪廓分割方法提取圖片序列中的輪廓圓，再采用LBP算法對拍攝圖片序列進(jìn)行復(fù)合輪廓處理和跟蹤；根據(jù)提出的算法統(tǒng)計(jì)圖像序列中標(biāo)定圓輪廓的真圓度與彌散圓面積數(shù)據(jù)并分析標(biāo)定景深。理論表明，提出的算法可以在不同倍率下測定景深范圍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該算法可以根據(jù)序列圖片較為有效地標(biāo)定景深，對后續(xù)圖像處理有重要意義。

景深；活動(dòng)輪廓；LBP；真圓度；彌散圓

0 引言

視覺系統(tǒng)可應(yīng)用于自動(dòng)化的檢測、測量以及控制。但這些操作精準(zhǔn)的前提是建立在鏡頭景深范圍內(nèi)［1］。景深與光學(xué)成像有關(guān)。在理想化的射線光學(xué)中，每條射線收斂到一個(gè)點(diǎn)時(shí)為聚焦?fàn)顟B(tài)，實(shí)際中成像由于衍射和畸變會(huì)產(chǎn)生軟邊緣的模糊光斑，邊緣分割的不穩(wěn)定導(dǎo)致景深范圍不易確定［2］。實(shí)際在固定焦距的條件下不同物距仍然可以出現(xiàn)清晰成像效果，清晰成像的距離范圍稱為景深（Depth-of-Field，DOF）。人們對景深有過初步的探討，提到了一些方法近似估計(jì)景深或處理景深問題，然而更傾向于換一種思路解決景深問題。例如，“改進(jìn)微透鏡”、編碼相機(jī)［3］、寬動(dòng)態(tài)［4］、去模糊算法［5］等等。在醫(yī)療、工業(yè)、或是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，景深對于觀察觀測都有著極大的影響［6，7］，但是在當(dāng)前工業(yè)中，景深的測量大多選擇人工干預(yù)或者更換器物的方式替代景深約束（如停留于人眼標(biāo)定，或者用激光灰度掃描景深標(biāo)定版進(jìn)行標(biāo)定），缺乏價(jià)格低廉的景深自動(dòng)標(biāo)定方法。

活動(dòng)輪廓就是一種基于能量的圖像分割方法，對特征描述、識別和理解等高層次的處理有著重大的影響［8］。利用能量密集度的活動(dòng)輪廓模型定位COC邊緣，使用LBP分割跟蹤C(jī)OC邊緣，并LBP是機(jī)器視覺領(lǐng)域的一種分類特征，該算子對光照具有不變性，能夠較好的提取出圓擴(kuò)散失真的邊緣，提升檢測效果［9］。彌散圓（Circle of Confusion，COC）用于描述一個(gè)點(diǎn)與一個(gè)最大模糊光斑點(diǎn)的區(qū)別。因?yàn)槠湟阅芰繑U(kuò)散為表現(xiàn)形式，通過評價(jià)“最大容忍彌散圓”可以間接反映景深信息。所以，根據(jù)COC直徑標(biāo)定景深具有可行性。

1 光學(xué)顯微鏡景深自動(dòng)標(biāo)定方法

光學(xué)鏡片都存在景深的限制。如圖1所示，以一個(gè)矩形范圍做景深示意圖（實(shí)際情況略有不同）。調(diào)整顯微鏡物距可在景深范圍內(nèi)觀測到清晰的物像，反之則是離焦模糊的圖像。由此現(xiàn)象，控制步進(jìn)電機(jī)從前離焦到后離焦等間隔連續(xù)拍攝，再根據(jù)本文活動(dòng)輪廓及LBP分割跟蹤算法得到序列圖像的相關(guān)參數(shù)，即可由COC真圓度和COC面積自動(dòng)標(biāo)定出景深范圍。

圖1 顯微鏡平臺組成示意圖

1.1 算法設(shè)計(jì)

針對不同光照環(huán)境及震動(dòng)噪聲等等對于圖片拍攝的影響，本文選取了基于能量的活動(dòng)輪廓分割以及具有光照魯棒性的LBP分割方法提取標(biāo)定輪廓。算法流程如圖2所示。

圖2 DOF標(biāo)定算法流程圖

首先，選取圓點(diǎn)標(biāo)定版，將其固定在顯微鏡載物臺上，利用步進(jìn)電機(jī)單向步進(jìn)移動(dòng)并連續(xù)拍攝標(biāo)定圖片序列；然后，對序列圖片進(jìn)行活動(dòng)輪廓分割，并且用LBP做分割跟蹤處理，統(tǒng)計(jì)標(biāo)定參數(shù)列表；最后，根據(jù)參數(shù)列表，進(jìn)行多閾值分析，判斷標(biāo)定圖片序列輪廓的真圓度和COC面積，得到滿足Ts（Ts＝Sbest－SL1＝Sbest－SL2）以及Δρ（真圓度偏差）的位置，L1，L2為臨界閾值序列標(biāo)簽，通過計(jì)算可得到DOF。

1.2 活動(dòng)輪廓

活動(dòng)輪廓算法是一種基于能量的分割算法，對輪廓進(jìn)行迭代運(yùn)算，可以彌補(bǔ)光暈產(chǎn)生的毛刺干擾，更為精準(zhǔn)的定位COC范圍。簡單的Sobel和Canny等邊緣檢測算子對能量信息不夠敏感，而活動(dòng)輪廓利用能量估計(jì)函數(shù)進(jìn)行邊界測定，保證了邊界的穩(wěn)定性。根據(jù)文獻(xiàn)［10］中的全局能量擬合模型可見式（1）：

式中，outside（C1）與inside（C1）分別代表區(qū)域輪廓C1的內(nèi)外邊界。c1、c2是圖像的2個(gè)亮度常量估計(jì)參數(shù)。式（1）的v｜C1｜為一個(gè)過擬合平滑約束的正則項(xiàng)，最終根據(jù)迭代得到標(biāo)定圓的相應(yīng)輪廓C1如圖3所示。其中，圖3（a）為經(jīng)過1000次迭代后的最終邊界輪廓收斂示意圖；圖3（b）為活動(dòng)輪廓水平集的三維示意圖，其x和y軸分布為圖像的長寬，z軸為圖像灰度反色歸一化到區(qū)間（－50，50）的灰度圖，并以顏色區(qū)分灰度值。

圖3 基于能量的活動(dòng)輪廓處理圖

1.3 LBP分割

LBP模型為式（2）：

式中，（xc，yc）是中心像素，ic為亮度，ip是相鄰像素的亮度。s（x）是一個(gè)符號函數(shù)，函數(shù)形式如式（3）：

LBP的基本思想是對圖像當(dāng)前像素和它鄰域像素進(jìn)行對比后的結(jié)果求和。以當(dāng)前像素為中心，對相鄰像素進(jìn)行閾值比較，如果中心像素的亮度大于或等于相鄰像素，則標(biāo)記為“1”，否則標(biāo)記為“0”。用二進(jìn)制數(shù)字來表示每個(gè)像素，例如00011110。由于周圍相鄰8個(gè)像素，最終可能獲取28個(gè)組合，該組合被稱為局部二值模式，有時(shí)也稱為LBP碼。利用LBP抗光照干擾特性，對一些內(nèi)部圓干擾進(jìn)行圖像處理，通過如下方式計(jì)算：

①將檢測窗口切分為區(qū)塊（cells，每個(gè)區(qū)塊3x3像素）；

②區(qū)塊中的每個(gè)像素，與其八鄰域像素按照順時(shí)針的順序進(jìn)行比較（左上、左中、左下、右上等）；

③中心像素大于某個(gè)鄰域的，設(shè)置為1；否則，設(shè)置為0。最終獲得一個(gè)8位的二進(jìn)制數(shù)（通常情況下會(huì)轉(zhuǎn)換為十進(jìn)制數(shù)字），作為該位置的特征。

根據(jù)活動(dòng)輪廓得到的輪廓C1，計(jì)算邊界點(diǎn)的Manhattan距離DM作為初步計(jì)算：

再根據(jù)候選外邊界點(diǎn)在各個(gè)方向出現(xiàn)的概率與內(nèi)邊界點(diǎn)q在鄰域位置序列上對應(yīng)值Dirq，對p、q兩點(diǎn)的距離DM作出相應(yīng)修正，如式（5）所示：

候選外邊界點(diǎn)方向權(quán)值計(jì)算公式如式（6）：

式中，Dir是位置序列，以中心像素左上方為起點(diǎn)按順時(shí)針走向8鄰域計(jì)算方向權(quán)重。再根據(jù)C1和相應(yīng)的權(quán)重計(jì)算內(nèi)輪廓跟蹤方向，得到相應(yīng)輪廓C。圖4為LBP分割跟蹤處理圖。

圖4 LBP處理圖

1.4 統(tǒng)計(jì)劃分與景深計(jì)算

步進(jìn)電機(jī)移動(dòng)的過程中，因?yàn)榫葐栴}，導(dǎo)致拍攝圓形標(biāo)定板的定向漂移現(xiàn)象發(fā)生，所以文中選取單個(gè)圓形標(biāo)定區(qū)域進(jìn)行序列跟蹤計(jì)算。由輪廓跟蹤序列，對標(biāo)定圖像序列圓輪廓進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行真圓度分析與COC測定，再標(biāo)定景深。景深與COC關(guān)系如圖5所示，其中，δ為COC的直徑。

圖5 景深與COC的關(guān)系

根據(jù)景深的定義將景深計(jì)算問題轉(zhuǎn)換成COC估計(jì)，以COC面積Sl作為一個(gè)全局能量約束，同時(shí)聯(lián)合真圓度約束。由輪廓跟蹤得到COC邊界C，然后由C的圖像空間信息計(jì)算出圓心Oi，再根據(jù)圓心Oi計(jì)算出序列圖像的真圓度ρ，真圓度計(jì)算公式為：

式中，Rmax為以O(shè)i為圓心輪廓Ci的最大圓半徑；Rmin以O(shè)i為圓心輪廓Ci的最小圓半徑；Ri為周長Ci＝2 π R得到不同圖像序列統(tǒng)計(jì)半徑，ρ越接近1表示越接近解析圓。設(shè)定閾值Δρ＝0.85作為初始約束統(tǒng)計(jì)粗景深范圍D1，再根據(jù)COC面積界限Ts進(jìn)行二次約束，計(jì)算COC圖像序列模糊邊界標(biāo)簽L1與L2。其中，Ts為最大容忍COC面積Si與聚焦平面圓點(diǎn)面積Sbest的差值。最終，可以根據(jù)Ts對應(yīng)的模糊邊界標(biāo)簽值L1與L2以及步進(jìn)長度s計(jì)算精景深范圍D。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置與設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)平臺采用南京波長光電科技有限公司的ZOOM460N體視顯微鏡，載物臺上放置一塊圓點(diǎn)標(biāo)定板，通過光路公用的物鏡傳送信息至頂部目鏡；目鏡直接通過轉(zhuǎn)接口連接到由日本W(wǎng)atec公司生產(chǎn)的兩個(gè)型號為902B攝像機(jī)，再通過USB采樣得到每幀704×576大小的圖像。

實(shí)驗(yàn)整體設(shè)計(jì)：利用圓點(diǎn)標(biāo)定板，做單向等距移動(dòng)拍攝，得到標(biāo)定圖片序列（實(shí)驗(yàn)中，拍攝了150張6 μm／step的圖像序列），再對圖像序列進(jìn)行活動(dòng)輪廓分割，并進(jìn)行LBP分割跟蹤，得到分析數(shù)據(jù)Rmax、Rmin、Ri與ρ。根據(jù)Δρ和Ts計(jì)算景深范圍D。

2.2 結(jié)果分析

活動(dòng)輪廓選用基于全局的能量分析，初始輪廓的選定不會(huì)對最終的收斂結(jié)果有較大影響，只會(huì)造成分割能量平衡時(shí)迭代終止次數(shù)不同，越接近實(shí)際輪廓的初始輪廓算法迭代次數(shù)越少。實(shí)驗(yàn)中選用了800次迭代為終止條件，圖6（a）為輸入圖像；圖6（b）為50次迭代步長的活動(dòng)輪廓過程示意圖；圖6（c）為LBP分割跟蹤邊界。根據(jù)圖6（c）輪廓得到相應(yīng)序列圖片統(tǒng)計(jì)，如表1所示。

圖6 單個(gè)標(biāo)定圓的處理圖

表1 標(biāo)定參數(shù)統(tǒng)計(jì)

表1中，L為對應(yīng)的步進(jìn)高度標(biāo)簽，ρ為不同L對應(yīng)的輪廓真圓度，Ri為標(biāo)定圓半徑，Si為標(biāo)定圓面積，Ci為標(biāo)定圓輪廓長度，ρ＞Δρ與Si＞Ts標(biāo)記為“1”，代表滿足條件ρ＞0.85與Si＞Ts時(shí)的圖像（若觀測平臺成像面與光軸的垂直度較高，可以提高真圓度ρ作為閾值限定），反之，標(biāo)記為“0”。由COC直徑定義，選取經(jīng)驗(yàn)值δ＝0.1pixel為最大允許的模糊直徑，根據(jù)數(shù)據(jù)提取Rmax＝17.316 1與圓面積公式Ts＝π（Rmax－δ）2計(jì)算得到景深DOF的界限閾值Ts＝931，即可利用式（8）計(jì)算景深；

其中，L1＝114，L2＝102，s為步進(jìn)電機(jī)每次拍攝垂直方向的移動(dòng)步長，測試環(huán)境中s＝6 μm，得到景深D＝72 μm。在Matlab測試平臺下局部區(qū)域處理效果圖如圖7所示。圖7（a）的橫坐標(biāo)是圖像序列標(biāo)簽，縱坐標(biāo)為真圓度數(shù)據(jù)，根據(jù)原始數(shù)據(jù)可得到其趨勢線擬合二次方程為：y＝－0．000 04x2＋0．007 6x＋0.485 7，對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)R2＝0.504 5；圖7（b）的橫坐標(biāo)也是圖像序列標(biāo)簽，縱坐標(biāo)為COC面積Si數(shù)據(jù)，根據(jù)原始數(shù)據(jù)可得到其趨勢線擬合二次方程為：y＝－0．499x2＋10．864x＋343．96，對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)R2＝0.886 3。根據(jù)表1與圖7擬合曲線方程分析可知：在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)平臺下，震動(dòng)移位干擾比較大，活動(dòng)輪廓分割與LBP跟蹤得到的輪廓不呈現(xiàn)光滑曲線的特性，但是真圓度ρ和COC面積Si變化大體趨勢為二次曲線模型，證明提出算法的景深標(biāo)定具有合理性。

圖7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)擬合圖

3 結(jié)束語

針對光學(xué)顯微鏡存在小景深且景深范圍不易測定的問題出發(fā)，提出了一種基于能量的活動(dòng)輪廓與LBP分割跟蹤C(jī)OC邊界的光學(xué)顯微鏡景深標(biāo)定方法，根據(jù)跟蹤得到的統(tǒng)計(jì)真圓度ρ和COC的面積Si數(shù)據(jù)進(jìn)行DOF標(biāo)定，最后，在實(shí)驗(yàn)平臺下根據(jù)本文算法可測得DOF為72 μm。理論推導(dǎo)表明，所提出的算法適用于不同倍率下景深范圍測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析證明，根據(jù)真圓度ρ與COC面積判定景深范圍具有科學(xué)性，而且標(biāo)定過程中只需要步進(jìn)電機(jī)等間距定向移動(dòng)拍攝，即可通過提出的算法有效的自動(dòng)測量景深范圍，對后續(xù)圖像處理有重要意義。

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Depth-of-Field Automatic Calibration of Optical Microscope Based on LBP

CUI Li，LI Chang-yang
（Faculty of Information Science and Engineering，Ningbo University，Ningbo Zhejiang 315211，China）

As small DOF of optical microscope，the unsharpness is imperceptible under normal viewing conditions.In response to this issue，an optical microscope automatic calibration method is proposed to measure DOF.The proposed method is based on the convex active contour model and LBP algorithm which is easy to work.Additionally，the proposed method provides lower cost than other methods.Firstly，spot calibrate board is fixed on the working stage controlled by the stepper motor，and the sequence images is captured by moving along z-axis from the front of DOF to the back of DOF equidistantly.Secondly，search the circle contour by active contour model in the sequence images.Then，LBP algorithm is utilized on the calibrate sequence images so as to get the circle contours more accurately.Finally，according to the roundness of the contours and circle areas in the statistics list，DOF of optical microscope is effective calibrated.Experimental results demonstrate that the proposed method can be used to measure the DOF on optical microscope，which is of great significance for the follow-up image processing.

Depth-of-Field；active contour model；LBP；roundness；Circle of Confusion

TP391.4

A

1003－3114（2015）06－79－5

10.3969／j.issn.1003－3114.2015.06.21

崔 力，李長陽.基于彌散圓的光學(xué)顯微鏡景深自動(dòng)標(biāo)定方法［J］.無線電通信技術(shù)，2015，41（6）：79－83.

2015－07－15

崔 力（1989―），男，碩士研究生，主要研究方向：顯微圖像處理測量技術(shù)。李長陽（1990―），女，碩士研究生。主要研究方向：顯微圖像處理測量技術(shù)。