不同金屬離子和pH對白腐菌Ganoderma lucidum產(chǎn)漆酶的影響

卞 丹，求璐慧，楊海龍

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035)

不同金屬離子和pH對白腐菌Ganoderma lucidum產(chǎn)漆酶的影響

卞 丹，求璐慧，楊海龍?

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035)

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度金屬離子，研究Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+等金屬離子的濃度和pH對白腐菌Ganoderma lucidum生產(chǎn)漆酶的影響．結果表明：Zn2+、Cu2+和Mn2+對G. lucidum生產(chǎn)漆酶有不同程度促進作用，其中Cu2+的促進作用最大，Mg2+在高濃度時促進產(chǎn)酶，F(xiàn)e2+則抑制漆酶的生產(chǎn)；pH為5時最利于漆酶的生產(chǎn)，酶活可達到140 000 U/L．

白腐菌；金屬離子；pH；漆酶

漆酶（Laccase）是一種結合4個銅離子的多酚氧化酶，其中Cu2+與酶以配位體的形式結合．在催化反應過程中，氧分子被還原為水，而漆酶從氧化底物分子中提取一個電子，使之形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，可自身結合或者相互偶聯(lián)，形成聚合物或偶聯(lián)物，此過程中不產(chǎn)生其他物質(zhì)[1]．漆酶可與多酚、木質(zhì)素、甾體等多種底物發(fā)生反應[2]，故在木質(zhì)素降解、生物制漿與漂白、染料的脫色、生物監(jiān)測等方面有著廣泛的應用[3-4]．漆酶主要分布于真菌、高等植物，在眾多生產(chǎn)漆酶的生物體中，白腐菌Ganoderma lucidum是最主要的生產(chǎn)者[1]．

目前，由于生產(chǎn)效率不高等原因，漆酶還未實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，如何提高漆酶產(chǎn)量與活力等問題尚在探索中．許多研究發(fā)現(xiàn)[5-7]金屬離子和pH對微生物產(chǎn)酶有重要影響，本研究以白腐菌Ganoderma lucidum WZ-32為生產(chǎn)菌，通過改變金屬離子濃度和pH來探究其對產(chǎn)酶的影響，以期優(yōu)化G. lucidum WZ-32生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件，為漆酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 菌 種

供試白腐菌G. lucidum WZ-32為溫州大學生命與環(huán)境科學學院發(fā)酵工程實驗室提供，菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，4℃保存．

1.2 主要試劑與儀器

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（簡稱ABTS）購自美國Sigma公司，檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為市售分析純．

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；Mettler-Toledo SevenEasy pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；ZHWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；VS-840K-U潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）．

1.3 漆酶發(fā)酵液的制備

將白腐菌G. lucidum WZ-32接種于100 mL種子培養(yǎng)基（葡萄糖2%，玉米粉2%，豆粕1%，硫酸鎂0.075%，磷酸氫二鉀0.15%，水，pH自然），在28℃、165 r/min搖床培養(yǎng)5 d．將種子液按10%的接種量接種到150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中（葡萄糖1%，玉米粉2%，豆粕1%，花生殼2%，硫酸鎂0.075%，磷酸氫二鉀0.075%，磷酸二氫鉀0.075%，水，pH自然），在28℃、165 r/min恒溫搖床培養(yǎng)5 d．發(fā)酵液常溫下濾紙過濾取其上清，適當稀釋測定漆酶活性．

1.4 漆酶測定方法

本實驗采用分光光度法[8]測定漆酶活力．反應總體系3 mL，含0.1 mL稀釋酶液，1.9 mL pH=3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和1.0 mL 0.5 mmol/L ABTS溶液．45℃水浴保溫3 min，于420 nm處測定吸光值，實驗重復3次，取平均值．每分鐘氧化1μmol底物所需要的酶量為1個酶活單位（U）．空白對照組中以蒸餾水代替酶液．

1.5 金屬離子對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入①本文實驗所涉及濃度均為重量百分濃度(w/v).0.06%的不同金屬離子（Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+），搖床培養(yǎng)5 d測其酶活．

1.6 金屬離子濃度對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中依次加入0、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%和0.1%的金屬離子（Zn2+、Cu2+、Mn2+和Fe2+），搖床培養(yǎng)5 d測其酶活．添加Mg2+時濃度分別為為0、0.025%、0.05%、0.075%、0.1%和0.125%．

1.7 pH對產(chǎn)酶的影響

將滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)液pH依次調(diào)節(jié)到4、4.5、5、5.5、6、6.5、7和7.5，搖床培養(yǎng)5 d測其酶活．

2 結果與討論

2.1 不同金屬離子對產(chǎn)酶的影響

金屬離子對漆酶的影響是多方面的，離子種類、離子電荷數(shù)和離子濃度等都會對酶的活性產(chǎn)生不一樣的影響[9]．在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.06%的不同金屬離子，搖床培養(yǎng)5 d測其酶活，探究不同金屬離子對G. lucidum WZ-32產(chǎn)酶的影響，結果見表1．

表1 不同金屬離子對產(chǎn)酶的影響

表1顯示，同等濃度下，Zn2+、Cu2+、Mn2+對產(chǎn)酶有不同程度的促進作用．在這三者中，Cu2+對產(chǎn)酶影響最大，漆酶活力顯著提高，Mg2+和Fe2+對漆酶活性有些許抑制作用．

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，銅是漆酶蛋白質(zhì)的結構組成，因此它的存在能有效提高真菌漆酶的產(chǎn)量．Collins P. J.[10]和Galhaup C.[11]等學者認為可能是銅離子能夠誘導漆酶基因轉錄合成蛋白，所以缺少和限制銅含量都會不利于漆酶的合成．Stajic M.等[12]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+和Mn2+對側耳屬的三種菌有不同的促進作用．Zn2+、Cu2+、Mn2+易與漆酶芳香基上的羰基、羧酸殘基結合，改變漆酶中心離子的結構，從而表現(xiàn)激活作用[5]．Fe2+通過與底物催化氧化產(chǎn)物ABTS自由基的反應來抑制漆酶的活力[13]．金屬離子作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素，對菌體的生長和相關代謝物的合成有重要影響．

2.2 金屬離子濃度對產(chǎn)酶的影響

不同金屬離子及濃度對產(chǎn)酶的影響見表2．

表2 不同金屬離子及濃度對產(chǎn)酶的影響

表2的結果顯示了不同金屬離子濃度對產(chǎn)酶的影響，其中Zn2+、Cu2+和Mn2+對G. lucidum生產(chǎn)漆酶有不同程度促進作用，F(xiàn)e2+則抑制漆酶的生產(chǎn)．由表2可以看出，Zn2+在其濃度小于0.1%時，對產(chǎn)酶影響表現(xiàn)為促進作用；且在濃度為0.06%時達到最大酶活，大約是對照組漆酶活性的2倍．Cu2+極大的促進了漆酶的產(chǎn)量，當培養(yǎng)基中Cu2+濃度為0.02%時漆酶活性最大，達42 014.35 U/L，大約是對照組漆酶活性的27倍，大大提升漆酶產(chǎn)量．因此在漆酶生產(chǎn)過程中可添加適量的Cu2+離子，以達到高產(chǎn)的效果．Stajic M.等[12]的研究也表明Cu2+的不同濃度使側耳屬三種菌種的漆酶活性得到不同程度的提高．實驗范圍內(nèi)不同的Mn2+濃度對漆酶產(chǎn)量的促進作用不明顯，較高濃度的Mg2+可促進G. lucidum WZ-32生產(chǎn)漆酶．Fe2+對漆酶的生產(chǎn)情況具有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用隨著濃度的增加而輕微增強．

2.3 pH對產(chǎn)酶的影響

漆酶是蛋白質(zhì)，并且是兩性電解質(zhì)，因此其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的解離程度受H+的影響，即培養(yǎng)基的pH對產(chǎn)酶有明顯影響．研究表明[14]過多的H+會影響漆酶活性中心結合集團的解離狀態(tài)，從而使得漆酶不能催化底物，還可能影響底物的解離狀態(tài)，使底物不能與漆酶結合，從而阻止催化反應進行．劉尚旭等[15]對糙皮側耳Ax3產(chǎn)漆酶條件進行研究，發(fā)現(xiàn)其最適pH為5.5．趙鳳霞等[9]對白腐菌Trametes pubescens MB89產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化探究，最終得出在不同底物影響下，產(chǎn)酶的最適pH不同．pH對漆酶活性的影響見圖1．

圖1 pH對漆酶活性的影響

圖1表明G. lucidum WZ-32產(chǎn)酶情況易受pH影響，且隨著pH變動產(chǎn)酶變化較大．當發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5，其產(chǎn)量最大，為140 000 U/L．當pH在4.0 – 5.0之間時，漆酶產(chǎn)量隨著pH的增大而快速提高，而當pH＞5.0時，漆酶產(chǎn)量隨著pH的增大而降低．這說明初始的pH條件對G. lucidum WZ-32生產(chǎn)漆酶具有重要影響，適當?shù)乃嵝詶l件能促進它的代謝作用，產(chǎn)生更多漆酶．

3 結 論

Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+等金屬離子對白腐菌G. lucidum WZ-32產(chǎn)酶影響不同，研究表明Zn2+、Cu2+和Mn2+對漆酶活性都有不同程度的促進作用，其中Cu2+對產(chǎn)酶的促進作用最大．當培養(yǎng)基中Cu2+濃度為0.02%時，漆酶活力最大，為42 014 U/L．Mg2+在高濃度時促進產(chǎn)酶，而Fe2+則完全抑制漆酶的生產(chǎn)，降低漆酶產(chǎn)量．此外，漆酶活性受pH變化影響較大，當pH為5.0時，活性最大，達140 000 U/L，也說明適當?shù)乃嵝詶l件更能促進G. lucidum WZ-32生產(chǎn)漆酶．

[1] 王佳玲, 余惠生, 付時雨, 等. 白腐菌漆酶的研究進展[J]. 微生物學通報, 1998, 25(4): 233-236.

[2] 趙世光, 王詩然, 薛正蓮, 等. Ganoderma lucidum UIM281產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件的篩選及響應面優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(11): 72-77.

[3] 馮文英, 常清榮, 李振巖. 麥草漿的木聚糖酶和漆酶/介體體系協(xié)同生物漂白研究[J]. 中國造紙學報, 2003, 18(2): 60-63.

[4] 王祎寧, 趙國柱, 謝響, 等. 漆酶及其應用的研究進展[J]. 生物技術通報, 2009, (5): 35-38.

[5] 方華, 黃俊, 陳瞾, 等. 緩沖體系和金屬離子對漆酶催化活性的影響[J]. 武漢理工大學學報, 2009, 31(5): 27-30.

[6] 王習文, 詹懷宇, 何為. 銅(Ⅱ)對漆酶活性的影響[J]. 紙和造紙, 2003, (4): 43-44.

[7] 張力, 花建麗, 王光輝, 等. 生命金屬離子對漆酶催化活性的影響[J]. 江西師范大學學報: 自然科學版, 1998, 22(3): 238-242.

[8] 林俊芳, 劉志明, 陳曉陽, 等. 真菌漆酶的酶活測定方法評價[J]. 生物加工過程, 2009, 7(4): 1-8.

[9] 趙鳳霞, 張莉. 白腐菌Trametes pubescens MB89產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及其部分酶學性質(zhì)的研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報, 2009, (4): 175-180.

[10] Collins P J, Dobson A. Regulation of laccase gene transcription in Trametes versicolor [J]. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(9): 3444-3450.

[11] Galhaup C, Haltrich D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Tremetes pubescens in the presence of copper [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, (56): 225-232.

[12] Stajic M, Persky L, Hadar Y, et al. Effect of copper and manganese ions on activities of laccase and peroxidases in three Pleurotus species grown on agricultural wastes [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2006, 128(1): 87-96.

[13] 王習文, 詹懷宇, 何為. 金屬離子對漆酶活性的影響[J]. 中華紙業(yè), 2003, 24(6): 33-35.

[14] 魏佳, 吳天祥, 楊海龍. 靈芝漆酶活性測定條件的優(yōu)化[J]. 井岡山大學學報: 自然科學版, 2011, 32(5): 51-54.

[15] 劉尚旭, 董佳里, 張義正. 糙皮側耳Ax3產(chǎn)漆酶條件及部分酶學性質(zhì)研究[J]. 四川大學學報: 自然科學版, 2004, 41(1): 160-163.

Effects of Diverse Metal Ions and pH on Laccase Production of Ganoderma Lucidum

BIAN Dan, QIU Luhui, YANG Hailong
(School of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)

This paper probes into the effects of metal ions with diverse concentration on laccase production in the submerged culture of Ganoderma lucidum via addition of Zn2+, Cu2+, Mn2+, Mg2+and Fe2+respectively in the fermentation media. The results indicate that the laccase production is accelerated at different degrees by the addition of Zn2+, Cu2+and Mn2+, among which Cu2+has the most promoting effect. While, Mg2+accelerates the laccase production at high concentration, but Fe2+has inhibitive effect on the laccase production. The effect of pH on the laccase production is also researched. When the pH value is set at 5, the enzyme activity reaches 140, 000 U/L, which is the best for the production of laccase.

Ganoderma lucidum; Metal ion; pH; Laccase

Q815

A

1674-3563(2015)02-0058-05

10.3875/j.issn.1674-3563.2015.02.009 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

(編輯：封毅)

2014-05-12

卞丹(1992- )，女，浙江慈溪人，研究方向：生物技術．? 通訊作者，yhl@wzu.edu.cn