雜色鮑精氨酸激酶基因的克隆及其在不同應激條件下的表達

李文輝,張 鑫,朱友芳,張子平,王藝磊*

(1.莆田市水產(chǎn)科學研究所,福建莆田351100;2.集美大學水產(chǎn)學院,農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室,福建廈門361021)

雜色鮑精氨酸激酶基因的克隆及其在不同應激條件下的表達

李文輝1,張 鑫2,朱友芳1,張子平2,王藝磊2*

(1.莆田市水產(chǎn)科學研究所,福建莆田351100;2.集美大學水產(chǎn)學院,農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室,福建廈門361021)

采用c DNA末端快速擴增(SMART-RACE)技術克隆了雜色鮑(Haliotis diversicolor)精氨酸激酶(Hd AK)基因;利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測了Hd AK基因在各組織中的表達量,并分析了高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染對鰓組織和血細胞Hd AK基因表達量的影響.結果顯示:Hd AK基因的cDNA全長1 595 bp,編碼354個氨基酸.所測定的各組織中Hd AK基因均有表達,與其他組織相比在肝胰腺中的表達量顯著提高(p＜0.05).在高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌感染實驗中,雜色鮑鰓組織和血細胞的Hd AK基因在實驗的部分時段顯著高于對照組,說明雜色鮑Hd AK不但參與能量代謝調節(jié),而且參與了雜色鮑對高水溫、低溶氧等不利環(huán)境的適應過程及機體免疫反應過程.研究結果可為揭示高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌感染對雜色鮑的生理影響的機制提供理論依據(jù).

雜色鮑;精氨酸激酶基因;高水溫應激;低溶氧應激;高水溫與低溶氧聯(lián)合應激;副溶血弧菌感染

精氨酸激酶(arginine kinase,AK)為磷酸激酶家族中的重要一員,廣泛存在于無脊椎動物中,是無脊椎動物體內調節(jié)能量代謝重要的酶之一[1],目前已有多種軟體動物的AK cDNA序列信息,包括泥蠟(Tegillarca granosa)[2]、長牡蠣(Crassostrea gigas,登錄號: AB118650)、池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii,登錄號: JF803293)、曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni,登錄號: HQ650787)、日本大鮑(Haliotis madaka,登錄號: D26104)、光滑雙臍螺(Biomphalaria glabrata,登錄號: GQ453432)、黑斑海兔(Aplysia kurodai,登錄號: AB059837)[3]等.現(xiàn)有研究表明,AK在水生動物機體適應低溶氧[4-5]等不良的環(huán)境變化、機體的免疫、機體防御病原感染[6-8]等方面發(fā)揮重要的作用.

雜色鮑(Haliotis diversicolor)為我國南方重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類,但在夏季由于高水溫、低溶氧及由弧菌引起的疾病嚴重制約了雜色鮑養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展[9],為此進行環(huán)境應激及病原感染對雜色鮑生理影響的研究是必要的,目前已進行了環(huán)境應激及病原感染與雜色鮑相關基因表達關系的研究,如高水溫及低溶氧應激對核因子κB(NF-κB)、核因子抑制蛋莊(IκB)和Akirin2[10]、缺氧誘導因子-1α(H d HIF-1α)[11]、雜色鮑紫色酸性磷酸酶(Hd PAP)[12]、酪氨酸3-加單氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋莊ζ(H d 14-3-3ζ)[13]、同種移植炎癥因子(H d AIF-1)[14]、熱休克轉錄因子1(H d HSF1)和熱休克蛋莊90 (Hd HSP90)[15]等基因的表達的影響;副溶血弧菌感染對Hd PAP基因[12]、H d AIF-1α[11]、NF-κB、IκB、Akirin2基因[10]和β-1,3-葡聚糖識別蛋莊基因(sa-βgrp)[16]表達的影響等.但雜色鮑AK(Hd AK)基因克隆及高水溫、低溶氧、弧菌感染對Hd AK基因表達的影響未見報道.為了給環(huán)境應激及病原感染對雜色鮑生理影響機制的研究提供理論依據(jù),本研究采用cDNA末端快速擴增(SMART-RACE)技術克隆了Hd AK基因并以該基因為研究對象,利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測了在高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌(Vibrio parah-aemolyticus)感染時基因的表達量.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 雜色鮑

實驗用雜色鮑體長(61.0±5.0)mm,質量(18.7 ±2.5)g,購回實驗室后在25℃的海水循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng),暫養(yǎng)期間每日喂1次海帶(Laminaria japonica),暫養(yǎng)10 d后進行實驗,實驗用水符合海水養(yǎng)殖用水水質要求.

1.1.2 試 劑

本研究所用的逆轉錄酶M-MLV、SYBR Green Realtime PCR Master Mix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒以及p MD19-T連接試劑盒分別購自Promega公司(美國)、捷瑞生物工程(上海)有限公司和寶生物(大連)公司.

1.1.3 所用引物

本研究用的引物全部由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成.3′RACE outer primer和3′RACEinner primer序列分別為5′-GACCATCTCCGTCTCATCTCCA-3′和5′-GACATTCTGCCCCAGCAACTT-3′,head primer和toe primer序列分別為5′-ATGGGTACTGAAAAACAGAAGT-3′和5′-TCAATTCTGTTCTTGCTGTTCAC-3′,Hd AK RTF和Hd AK RTR序列分別為5′-ACGTCCTCGATGCGGTTATC-3′和5′-ACTGAACTTCTCGAAGGCGG-3′.Universal Primer Mix、Nested U-niversal primer、5′CDS primer、3′CDS primer、SMARTⅡ、β-actin-F和β-actin-R的序列與文獻[12]相同.

1.2 方 法

1.2.1 高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌感染實驗

在高水溫實驗中,以水溫25℃為對照組,實驗組每小時升1℃至31℃進行0 h取樣并開始計時;低溶氧應激、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌感染實驗參照文獻[10]的方法.低溶氧應激實驗組溶解氧為2 mg/L,對照組為空氣曝氣(溶氧約為5.5 mg/L);高水溫與低溶氧聯(lián)合應激實驗組升溫及計時方法與高水溫實驗相同,溶解氧為2 mg/L,對照組水體經(jīng)空氣曝氣(溶氧約為5.5 mg/L)、水溫維持在25℃;副溶血弧菌感染實驗組每只雜色鮑注射50μL濃度為6.7 ×107cfu/m L的副溶血孤菌,對照組注射50μL生理鹽水.鮑血細胞是先天免疫防御系統(tǒng)的主要免疫細胞,鰓組織為水生動物與環(huán)境接觸的第一屏障,因此本研究以雜色鮑血細胞、鰓組織為對象研究H d AK基因的表達量變化.實驗組與對照組在每個采樣時間點分別取5只,血淋巴經(jīng)離心后棄上清,所得的血細胞保存于ˉ80℃冰箱中;鰓組織保存于液氮中,用于RNA的提取.

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成

根據(jù)王藝磊等[17]實驗方法,提取雜色鮑鰓組織以及血細胞總RNA,按照逆轉錄試劑盒的說明進行cDNA的合成.

1.2.3 Hd AK基因cDNA全長序列的克隆

采用SMART-RACE的方法獲得H d AK基因的cDNA全長序列,利用head to toe引物驗證其開放閱讀框(ORF)的準確性.

1.2.4 Hd AK的生物信息學分析

用Blast(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)和ORF Finder(http:∥ww w.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/orfig.cgi)等工具驗證所得片段是否為目的基因;用Ex PASy(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)推測Hd AK的等電點及分子質量;用SingalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)判斷有無信號膚序列;用NetPhos 2.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)對磷酸化位點進行預測;用Net NGlyc1.0 Server(http:∥w ww.cbs.dtu.dk/services/Net NG-lyc/)對糖基化位點進行預測;用BioEdit軟件進行序列的多重比對;用MEGA5.05軟件構建系統(tǒng)進化樹.

1.2.5 Hd AK基因在雜色鮑各組織及不同應激條件下的表達

以β-actin作為內參基因,H d AK基因表達量測定的q RT-PCR反應混合液為SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10μL、10μmol/L的Hd AK RTF primer和Hd AK RTR primer各0.5μL以及cDNA模板9μL.反應條件為95℃1 min;后95℃15 s,60℃1 min,40個循環(huán).利用SPSS 20.0進行顯著性差異分析,p＜0.05為差異顯著.

2 結 果

2.1 Hd AK基因的克隆、序列分析及空間結構模擬

通過RACE的方法獲得了H d AK(Gen Bank登類聚為一大支,而雜色鮑首先和日本大鮑聚為一小支,然后和其他軟體動物單獨聚為一大支.錄號:KM433667)的cDNA全長為1 595 bp,其中, 5′非編碼區(qū)(5′UTR)、3′UTR和ORF分別為49, 481和1 065 bp.編碼的氨基酸為354個(圖1). H d AK分子質量為39.7 ku,等電點6.24,不含信號膚序列.由圖1可見,H d A K有5個絲氨酸磷酸化位點、5個蘇氨酸磷酸化位點和6個酪氨酸磷酸化位點.

2.2 編碼AK蛋白序列的多重比對以及系統(tǒng)進化樹的構建

圖2為多重序列比對結果,由圖中可見AK蛋莊具有較高的保守性,但其氨基酸的長度仍有一定的差異.Blast分析得出,H d AK與同為鮑屬的日本大鮑的AK相似性最高,達到了91%.

圖3為系統(tǒng)進化樹.圖中可見,節(jié)肢動物和線蟲

圖1 雜色鮑Hd AK基因c DNA及其氨基酸序列Fig.1 The cDNA and amino acid sequence of Hd AK gene from H.diversicolor

圖2 Hd AK和其他物種AK氨基酸序列的多重比對Fig.2 Multiple alignment of the AK amino acid sequence between H.diversicolor and other species

圖3 Hd AK和其他物種AK氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the AK amino acid sequences between H.diversicolor and other species

2.3 雜色鮑不同組織Hd AK基因的表達

由圖4可見,所測定的各組織中Hd AK基因均有表達,與其他組織相比在肝胰腺中的表達量顯著提高(p＜0.05).

圖4 Hd AK基因在雜色鮑各組織器官的表達情況Fig.4 Distribution pattern of Hd AK in different tissues of H.diversicolor

2.4 Hd AK基因在高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧應激以及副溶血弧菌感染后的表達

高水溫應激開始階段,Hd AK基因在雜色鮑鰓組織中的表達量不存在顯著性差異.當應激時間達到4 h,H d AK基因的表達量顯著性上調,之后又迅速恢復到和對照組相似的水平(圖5(a)).在血細胞中, Hd AK基因的表達量分別在0 h和4 h表達量顯著上調,隨后又迅速恢復到對照組的表達水平(圖5(b)).

qRT-PCR結果顯示,低溶氧環(huán)境下,H d AK基因在鰓組織中的表達量分別在4,96和192 h顯著上調,并且在192 h,表達量上升達到頂峰(圖6(a)).在低溶氧誘導的起始階段,H d AK基因在血細胞中的表達量未檢測到顯著性變化,當處理達到24 h,實驗組的表達量顯著上調,隨后,在96和192 h雖然表達量有所下降但這一顯著性差異依舊存在(圖6(b)).

高水溫與低溶氧聯(lián)合應激條件下,在鰓組織中在4和192 h時實驗組顯著高于對照組(p＜0.05)(圖7 (a)).在血細胞中,在0和4 h,實驗組顯著高于對照組(p＜0.05)(圖7(b)).

在副溶血弧菌感染后,在實驗組雜色鮑鰓組織中Hd AK基因的表達量分別在3,6和12 h時顯著高于對照組,24 h這一顯著性差異消失(圖8(a)).在血細胞中,處理3 h,H d AK基因的表達量顯著上調,之后的時間內,雖然實驗組H d AK基因的表達量有所下降,但這一顯著性變化在6和12 h仍然存在,處理24 h,隨著Hd AK基因的表達量的繼續(xù)下調,這一顯著性差異消失,并恢復到與對照組無顯著性差異的水平(圖8(b)).

圖5 高水溫應激后各時期Hd AK基因在鰓組織(a)及血細胞(b)中的表達Fig.5 The change of Hd AK after thermal stress in gills(a)and haemocytes(b)

圖6 低溶氧應激后各時期Hd AK基因在鰓組織(a)及血細胞(b)中的表達Fig.6 The change of Hd AK after hypoxia stress in gills(a)and haemocytes(b)

圖7 高水溫與低溶氧聯(lián)合應激處理后Hd AK基因在鰓組織(a)及血細胞(b)中的表達Fig.7 The change of Hd AK after thermal&hypoxia stress in gills(a)and haemocytes(b)

3 討 論

Hd AK的cDNA全長為1 595 bp,其中,5′UTR為49 bp,3′UTR為481 bp以及1 065 bp的ORF,編碼354個氨基酸,Hd AK基因推導的氨基酸序列與其他動物的AK氨基酸序列有較高的相似度,特別是與日本大鮑的相似性達到91%,說明AK具較高的保守性.但氨基酸的多重比對表明不同物種AK氨基酸的長度也存在一定的差異.

圖8 副溶血弧菌感染后Hd AK基因在鰓組織(a)及血細胞(b)中的表達Fig.8 The change of Hd AK after V.parahaemolyticus challenge in gills(a)and haemocytes(b)

一般來說,AK的酶活性中心區(qū)域都具有7個氨基酸殘基序列(CPTNLGT),酶活性中心位點都是由高度保守的半胱氨酸殘基(C)組成[18],但有些種類的氨基酸殘基序列第3位蘇氨酸(T)被絲氨酸(S)代替,并不影響其功能.本研究中的雜色鮑H d AK活性中心氨基酸殘基序列即為CPSNLGT(266～272),與日本大鮑、光滑雙臍螺、黑斑海兔[3]、曼氏無針烏賊的序列相同.

已有的研究結果表明,在大多數(shù)無脊椎動物體內各組織中,AK基因均有表達[19],本次測定結果也證實了這一點,在本次測定的7種組織中,AK基因均有表達.在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)等甲殼類在肝胰腺中AK基因表達量顯著低于鰓組織和血細胞[8,20],而Hd AK在肝胰腺中表達量則顯著高于鰓組織和血細胞,這可能與甲殼類游泳生活而雜色鮑的匍匐生活有關.Hd AK在肝胰腺中表達量最高說明肝胰腺在調節(jié)能量代謝、適應不良的環(huán)境變化、防御病原侵襲等方面發(fā)揮了很大的作用.

日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)在缺氧條件下,肌肉中AK基因的表達量明顯上調,肌肉中磷酸精氨酸的含量明顯下降[5];紅鮑(H.rufescens)在缺氧時AK上升[4];凡納濱對蝦在WSSV感染時肌肉的AK的表達量上調[7];三疣梭子蟹在溶藻弧菌(V. alginolyticus)感染后肌肉的AK的表達量顯著上調[8];感染W(wǎng)SSV病毒的細角濱對蝦(P.stylirostris),AK基因的表達量高出對照組2.84倍[6],這些研究表明,AK基因不但在生物體適應不利環(huán)境中起作用,而且還參與機體的免疫反應[18].本研究以雜色鮑血細胞、鰓組織為研究對象檢測其在高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激和副溶血弧菌感染各采樣時間點Hd AK的cDNA的表達量變化情況,結果表明在各實驗中雜色鮑血細胞、鰓組織的Hd AK的cDNA的表達量在部分時段顯著高于對照組,說明該基因參與了高水溫、低溶氧等不利環(huán)境的適應過程及免疫反應過程,Hd AK對環(huán)境應激及副溶血弧菌感染反應敏感,可作為判斷環(huán)境因素及細菌感染是否對雜色鮑產(chǎn)生應激的依據(jù)之一.

高水溫及低溶氧應激抑制了雜色鮑H d PAP基因的表達[12],提高了H d 14-3-3ζ[13]、Hd AIF-1[14]、Hd HIF-1α[11]、Hd HSF1和Hd HSP90[15]、NF-κ、BIκB、NF-κB和Akirin2[10]等基因的表達水平;在副溶血弧菌感染下Hd PAP[12]表達抑制,AIF-1、NF-κB、IκB、NF-κB、Akirin2[10]和sa-β-grp[16]等基因表達上調.以上研究結果表明,雜色鮑在高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌感染時可誘導參與多種生物學過程的基因表達水平發(fā)生變化,本實驗的結果顯示雜色鮑在高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激以及副溶血弧菌感染應激時Hd AK基因表達水平上升,基因表達水平的變化增加了雜色鮑的能量供應,雜色鮑對高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激以及副溶血弧菌感染的響應是一個耗能的過程.

在高水溫及高水溫與低溶氧聯(lián)合應激實驗中,血細胞H d AK基因0 h表達量顯著上升,低溶氧應激實驗中在0 h血細胞Hd AK基因表達量卻沒有上升,可見血細胞H d AK基因在實驗升溫過程中已產(chǎn)生應激反應,每小時升1℃由25℃升至31℃的升溫方式已影響到雜色鮑的正常生理代謝.這一結果與鰓部Hd AIF-1基因在高水溫實驗升溫過程表達量顯著上調的趨勢相似[14].

鰓組織H d AK基因表達量在高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌感染時出現(xiàn)顯著上升開始的時間分別為4,4,4和3 h,而血細胞H d AK基因表達量則分別在0,24,0和3 h時顯著上升.由此可以得出,血細胞Hd AK基因對高水溫、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激的反應比鰓組織Hd AK基因敏感,與血細胞Hd AK基因相比鰓組織Hd AK基因對溶氧的變化更為敏感,鰓組織H d AK基因和血細胞Hd AK基因在弧菌感染時敏感性沒有顯著的差異.在高水溫應激實驗中,鰓組織Hd AIF-1基因在升溫過程中表達量出現(xiàn)顯著性上調[14],Hd HIF-1α基因在升溫過程中表達量沒有顯著上調,直至水溫穩(wěn)定在31℃后1 h才出現(xiàn)顯著上調[11],本次實驗中鰓組織Hd AK基因在水溫升至穩(wěn)定在31℃后4 h才出現(xiàn)顯著上調.這些結果說明同一基因在不同的組織中及同一組織中不同的基因對同一種應激的敏感性不同,這可能與各自功能不同有關.

總之,本研究對H d AK的cDNA序列進行克隆和分析,以血細胞和鰓組織為研究對象,對H d AK基因在高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌感染后的表達規(guī)律進行測定,結果顯示Hd AK參與了高水溫、低溶氧等不利環(huán)境的適應過程及免疫反應過程,研究結果可為揭示高水溫、低溶氧、高水溫與低溶氧聯(lián)合應激及副溶血弧菌感染對雜色鮑的影響機制提供理論依據(jù).

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Cloning and Differential Expression of Arginine Kinase Gene in Haliotis diversicolor under Different Stresses

LI Wen-hui1,ZHANG Xin2,ZHU You-fang1,ZHANG Zi-ping2,WANG Yi-lei2*
(1.Putian Municipal Institute of Fishery Science,Putian 351100,China;2.Key Laboratory of Healthy Mariculture for East China Sea,Ministry of Agriculture,Fisheries College,Jimei University,Xiamen 361021,China)

:The full length cDNA of arginine kinase gene(Hd AK)from Haliotis diversicolor was cloned for the first time by SMART-RACE method.The m RNA expression levels of Hd AK in examined tissues and in gill and haemocytes under thermal stress,hypoxia exposure,thermal plus hypoxia stress and the injection of Vibrio parahaemolyticus were analyzed by real-time quantitative PCR(qRT-PCR).Results showed that the full length c DNA sequence of Hd AK is 1 595 bp and encodes 354 amino acids.The qRT-PCR results showed that Hd AK gene was detected in all examined tissues and with the highest expression level in hepatopancreas(p＜0.05).Under different stresses,the m RNA expression levels in either gills or haemocytes of Hd AK gene were signi fi cantly up-regulated in some phases.These results indicated that Hd AK is involved in response to energy metabolism and plays roles in response to thermal,hypoxia stress and the injection of V.parahaemolyticus.These results will facilitate the study of the physiological mechanisms of these stresses on H.diversicolor.

Haliotis diversicolor;arginine kinase gene;thermal stress;hypoxia stress;thermal plus hypoxia stress;Vibrio parahaemolyticus infection

Q 785;S 968.3

A

0438-0479(2015)03-0315-09

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.03.004

2014-10-16 錄用日期:2015-01-14

國家自然科學基金(41176152);莆田市科技局項目(2014N07);集美大學創(chuàng)新團隊基金(2010A001)

*通信作者:ylwang@jmu.edu.cn

李文輝,張鑫,朱友芳,等.雜色鮑精氨酸激酶基因的克隆及其在不同應激條件下的表達[J].廈門大學學報:自然科學版,2015,54(3):315-323.

:Li Wenhui,Zhang Xin,Zhu Youfang,et al.Cloning and differential expression of arginine kinase gene in Haliotis diver

sicolor under different stresses[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(3):315-323.(in Chinese)