基于共振光散射技術(shù)的生物化學(xué)和分析化學(xué)檢測(cè)方法研究

段 輝，劉 蘭，劉振林，蔡 興

(甘肅省分析測(cè)試中心，甘肅蘭州730000)

基于共振光散射技術(shù)的生物化學(xué)和分析化學(xué)檢測(cè)方法研究

段 輝，劉 蘭，劉振林，蔡 興*

(甘肅省分析測(cè)試中心，甘肅蘭州730000)

文章綜述了共振光散射探針的應(yīng)用技術(shù)與原理，探討了探針類化合物在蛋白質(zhì)、核酸及痕量金屬離子的檢測(cè)方法及影響因素，為蛋白質(zhì)和核酸分析方法的建立、螺旋結(jié)構(gòu)及生物化學(xué)的研究提供思路，為提升金屬離子檢測(cè)限提供方法和依據(jù).

光散射探針;蛋白質(zhì);核酸;金屬離子;檢出限

光散射技術(shù)在物理化學(xué)、膠體化學(xué)和高分子化學(xué)研究中具有十分重要的地位,但在生物化學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域中尚未得到充分應(yīng)用，且在傳統(tǒng)的熒光測(cè)定中散射光常被做為一種干擾源被設(shè)法濾除.直到1993年才利用普通熒光分光光度計(jì)建立了通過(guò)共振光散射技術(shù)研究生物大分子的識(shí)別、組裝和聚集的新方法[1].其機(jī)理是有機(jī)染料在蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子上進(jìn)行堆積，導(dǎo)致烈的共振光散射增強(qiáng)，信號(hào)強(qiáng)度與生物大分子的濃度呈線性關(guān)系.共振光散射技術(shù)還可研究有機(jī)染料誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和核酸分子的構(gòu)象變化以及核酸超螺旋結(jié)構(gòu)的形成，并用于痕量金屬離子的檢測(cè)[2].本文針對(duì)光散射技術(shù)原理及其應(yīng)用進(jìn)行探討.

1 有機(jī)染料分子聚集的共振光散射技術(shù)

在普通的熒光分光光度計(jì)上選擇合適的激發(fā)和發(fā)射通帶寬度，采用相等的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)同時(shí)掃描單色器所得的同步光譜(即Δλ=0 nm)，即為散射粒子的共振光散射光譜.在儀器條件一定時(shí)，共振光散射強(qiáng)度與散射粒子的濃度成正比，據(jù)此可以用于散射粒子的定量測(cè)定.

利用共振光散射技術(shù)與吸收光譜法結(jié)合Pasternack研究14種卟啉化合物及二酸的堆集.由于靜電引力和疏水作用[3]，陰離子卟啉常形成分子聚集體，從而提高平面振子的簡(jiǎn)并度. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)四-(4-磺酸基苯基)卟啉(H2TPPS4)和三-(4-磺酸基苯基)卟啉(H2TPPS3)除了在434 nm處有峰外，在489 nm處也出現(xiàn)了小峰且H2TPPS4的強(qiáng)度小于H2TPPS3.盡管H2TPPS4在489 nm處的峰強(qiáng)度只有434 nm峰的1%，但卻被共振光散射技術(shù)準(zhǔn)確地檢測(cè)到了.H2TPPS4和H2TPPS3在489 nm處出現(xiàn)的峰是由于電感偶合的卟啉聚集體而形成的[4、5].該峰只有在高酸度、高離子強(qiáng)度和卟啉濃度較大時(shí)才能得到，非離子卟啉H2THPP在水中以聚集態(tài)存在，在440～480 nm處存在強(qiáng)烈的共振光散射信號(hào)，有機(jī)溶劑可使H2THPP解聚，導(dǎo)致共振光散射信號(hào)降低.

在生物學(xué)上，葉綠體的聚集是葉綠體光化學(xué)和光物理行為的決定因素，與卟啉一樣，葉綠體的聚集影響大環(huán)結(jié)構(gòu).研究表明，葉綠素在對(duì)應(yīng)于469 nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振光散射增強(qiáng)信號(hào)，而在699 nm處產(chǎn)生與Qy帶相對(duì)應(yīng)的共振光散射峰.由此認(rèn)為，葉綠體的聚集包括3個(gè)步驟：①二聚物的成核.②形成具有二級(jí)結(jié)構(gòu)傾向的大聚體.③形成螺旋聚集體.

鈷試劑(5-Cl_PADAB)在堿性條件下不穩(wěn)定，隨時(shí)間增加出現(xiàn)沒(méi)有峰形變化的吸收光譜降低和共振光散射光譜的增強(qiáng)信號(hào)，但吸收峰位于458.4 nm,而最大共振光散射峰位于570 nm.雖然最大吸收與散射相距較遠(yuǎn)，但研究表明這種現(xiàn)象是由于鈷試劑在堿性條件下發(fā)生了分子聚集[6].

2 在蛋白質(zhì)測(cè)定中共振光散射探針的應(yīng)用

表1 共振光散射測(cè)定蛋白質(zhì)體系

有機(jī)小分子(如有機(jī)染料)與生物大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸作用時(shí)，結(jié)合數(shù)一般都較大，相當(dāng)于有機(jī)小分子在生物大分子上進(jìn)行堆積，因而能產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振光散射增強(qiáng)信號(hào).以有機(jī)染料作為蛋白質(zhì)的光散射探針定量蛋白是基于蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)染料的光散射信號(hào)的放大效應(yīng)[7～8].光散射信號(hào)的增強(qiáng)與蛋白質(zhì)的含量呈線性關(guān)系，從而可進(jìn)行蛋白質(zhì)分析.常用于蛋白質(zhì)分析的光散射探針見(jiàn)表1所示.大多數(shù)探針屬于三苯甲烷類，還有卟啉類、偶氮類等[9～12].溴酚藍(lán)、鉻天青S、鋁試劑、四碘酚磺酞均屬于非聯(lián)苯型三苯甲烷試劑，而溴聯(lián)苯三酚紅、茜素紫和茜素菁綠屬于聯(lián)苯型染料.這些探針染料含有帶電荷的親水性集團(tuán)，如磺酸基、羧基、酚羥基以及不帶電荷的疏水性基團(tuán)，如苯環(huán)及其他芳香性大環(huán).蛋白質(zhì)和染料探針之間以非共價(jià)鍵形式結(jié)合.在酸性條件下,帶有相反電荷的染料與蛋白質(zhì)以靜電力相結(jié)合,同時(shí)非靜電力(疏水力、范德華力、羥基力)與之協(xié)同作用.而蛋白質(zhì)之所以對(duì)有機(jī)染料的光散射信號(hào)有放大效應(yīng)，這與它們的反應(yīng)模型有關(guān).根據(jù)有關(guān)的光散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，由于蛋白質(zhì)多膚鏈各部分的非極性側(cè)鏈在疏水力作用下形成疏水核.其表面分布著許多帶電荷的側(cè)鏈，在酸性條件下帶正電荷，因此，蛋白質(zhì)上有許多結(jié)合位點(diǎn).帶負(fù)電荷的有機(jī)染料由于靜電力被吸引至蛋白質(zhì)表面，染料的非極性基團(tuán)以疏水力和蛋白質(zhì)的疏水核結(jié)合，在蛋白質(zhì)的表面形成一個(gè)有機(jī)染料的覆蓋層,這種以蛋白質(zhì)為支撐核心的大染料聚合體體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于染料自身聚集體的體積.由于粒子直徑在5～100 nm時(shí)光散射信號(hào)與聚合體體積的二次方成正比，與單位體積內(nèi)粒子數(shù)目即聚合體濃度也成正比，因此與蛋白質(zhì)結(jié)合后的染料的光散射信號(hào)急劇增加,并與加入的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系.因?yàn)楣馍⑸湫盘?hào)在溶質(zhì)的吸收帶附近可以被大大增強(qiáng)〈所謂的共振光散射),而且摩爾吸收系數(shù)越大，可能產(chǎn)生的光散射信號(hào)越強(qiáng).所以，理想蛋白質(zhì)的有機(jī)染料光散射探針應(yīng)該有大的電子共軛環(huán)，有強(qiáng)的芳香性或疏水性并帶有負(fù)電荷的親水性基團(tuán)，如磺酸基、羧基和酚羥基，水溶性或醇溶性好.這些探針中已經(jīng)建立了以偶氮試劑對(duì)磺基苯偶氮變色酸作為光散射探針的微量蛋白質(zhì)測(cè)定方法.

3 在核酸分析中共振光散射探針的應(yīng)用

核酸是最早用光散射技術(shù)來(lái)研究和分析的生物大分子物質(zhì).早在1984年，knoll等就提出了以染料鍵合DNA引起染料的共振光散射增強(qiáng)進(jìn)行DNA的光散射標(biāo)記，但是并未引起足夠的重視.直到1993年P(guān)asternack才將光散射技術(shù)用于研究卟啉的J型堆積，即沿長(zhǎng)軸包含線性振蕩子極化的棒狀組裝.1995年，共振光散射技術(shù)作為一種研究色團(tuán)聚集的新方法被正式提出.水溶性卟啉試劑TAPP是首先被用作核酸光散射分析的染料[13].它是一個(gè)帶正電荷的大環(huán)共軛分子，與β型DNA作用不是嵌合式，而是卟啉取代基上的正電荷與核酸骨架上的磷酸根之間的靜電作用[14].核酸對(duì)水溶性游離堿卟啉TMpyP-4、TAPP都有減色效應(yīng),但只對(duì)TAPP及質(zhì)子化TAPP產(chǎn)生共振光散射增強(qiáng).進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TAPP及質(zhì)子化TAPP在核酸表面堆積，導(dǎo)致核酸超螺旋結(jié)構(gòu)的形成，如果核酸是質(zhì)子化的，將發(fā)生從核酸到卟啉TAPP的質(zhì)子轉(zhuǎn)移.在超螺旋結(jié)構(gòu)中，堆積在核酸表面的卟啉分子結(jié)合產(chǎn)生了染料分子的高線性密度,導(dǎo)致了有效的電子激發(fā)離域，共振光散射增強(qiáng)就是由于這種核酸超螺旋結(jié)構(gòu)中電子激發(fā)離域所引起的.利用核酸對(duì)TAPP的共振光散射增強(qiáng)可以測(cè)得納克級(jí)的核酸，測(cè)定檢測(cè)限比熒光淬滅法低一個(gè)數(shù)量級(jí)[15～19].

分光光度法研究表明,在堿性介質(zhì)中鈷(II)/鈷試劑絡(luò)合物與變性核酸作用,每個(gè)核苷酸殘基上能結(jié)合2個(gè)二元絡(luò)合物分子，形成了二元絡(luò)合物分子在單鏈核酸上的堆積[5].利用共振光散射技術(shù)同樣獲得鈷(II)/鈷試劑配合物在核酸分子上的這種堆積，這種堆積導(dǎo)致核酸在547 m處使二元絡(luò)合物的共振光散射信號(hào)劇烈增強(qiáng)，出現(xiàn)一個(gè)正好與三元復(fù)合物的吸收相對(duì)應(yīng)的尖峰.利用此處共振光散射增強(qiáng)信號(hào)能測(cè)定納克級(jí)的核酸，檢測(cè)限低于1 μg/L，低于溴己錠熒光法.常用于核酸分析的光散射探針[20～25]見(jiàn)表2.

4 共振光散射探針在痕量金屬離子測(cè)定中的應(yīng)用

早在1995年研究發(fā)現(xiàn)羅丹明染料與離子締合物產(chǎn)生共振發(fā)射光譜.在羅丹明染料的吸收波長(zhǎng)和熒光發(fā)射波長(zhǎng)之間出現(xiàn)強(qiáng)烈的共振光散射.碘負(fù)離子的存在使散射峰降低,而在更長(zhǎng)波區(qū)形成新的共振光散射峰.如果進(jìn)一步與金屬離子形成締合物，共振光散射峰還略有紅移并增強(qiáng).類似地,堿性三苯甲烷類染料如結(jié)晶紫、孔雀石綠、亮綠、碘綠等都有較弱的共振光散射信號(hào),當(dāng)其與碘負(fù)離子和金屬離子形成離子締合物時(shí),將形成新的共振光散射光譜,據(jù)此可以測(cè)定納克級(jí)的金屬離子如Hg2+、Cr3+、Se4+、Mo5+等.如果逐點(diǎn)測(cè)定上述堿性三苯甲烷類染料在λem=(1/2)λem λem=2λem的散射光強(qiáng)度,可以獲得較弱的二級(jí)散射(DS)和反二級(jí)散射(ADS).但當(dāng)這些染料與碘負(fù)離子和金屬離子作用形成離子締合物時(shí),將產(chǎn)生新的二級(jí)散射和反二級(jí)散射光譜,從而建立起基于離子締合物的二級(jí)散射和反二級(jí)散射光譜的納克級(jí)金屬離子Hg2+和Se4+的分析測(cè)定方法[26～33].但二級(jí)散射和反二級(jí)散射的信號(hào)強(qiáng)度都比共振光散射信號(hào)弱,所建立的方法靈敏度相對(duì)低于基于共振光散射增強(qiáng)方法的靈敏度.離子締合物的二級(jí)散射和反二級(jí)散射光譜變化是由于離子締合物的形成使得靜電引力、疏水作用導(dǎo)致分子間電荷轉(zhuǎn)移以及反應(yīng)前后分子大小差異所致.三氮烯試劑m-硝基苯偶氮-2-氨基噻唑與銀離子在微堿性介質(zhì)中形成1︰1配合物,顯示強(qiáng)烈的共振增強(qiáng)的瑞利光散射,由此可以測(cè)定微克級(jí)銀離子.共振光散射測(cè)定痕量金屬離子見(jiàn)表3.

表2 共振光散射測(cè)定核酸體系

表3 共振光散射測(cè)定痕量金屬離子

光散射探針目前可用于對(duì)氣體(如大氣微粒、煙、星際間塵埃等),液體,溶液(如膠體溶液、懸浮液、乳狀液及各種天然和合成的高分子溶液等)、固體、晶體及液晶的研究.就所涉及的工業(yè)和科學(xué)領(lǐng)域來(lái)說(shuō),光散射探針已應(yīng)用于石油化工、紡織纖維工業(yè)、橡膠、塑料工業(yè)、無(wú)機(jī)工業(yè),以及材料科學(xué)、礦物學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、固體物理學(xué)、半導(dǎo)體物理學(xué)、地球物理學(xué)及宇宙空間等方面的研究，成為一種不可缺少的實(shí)驗(yàn)手段，它具有廣闊的應(yīng)用前景.盡管光散射理論己較為成熟,但共振光散射探針從1993年誕生至今,在其應(yīng)用和研究中還有很多不足，因此要全面地理解和應(yīng)用還需要大量的探索工作.

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2015-05-20

*

段輝(1965—)，女，博士，研究員，主要從事分析化學(xué)及其應(yīng)用.

O657.3

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1009-2102(2015)02-0030-06