利塞膦酸對硅酸鈣骨水泥材料性能影響及體外釋放機(jī)理的研究

鞏天星 張延 陳亞東 馬賀 崔笑宇鄒云鵬

論著·實(shí)驗(yàn)研究

利塞膦酸對硅酸鈣骨水泥材料性能影響及體外釋放機(jī)理的研究

鞏天星 張延 陳亞東 馬賀 崔笑宇鄒云鵬

目的 探討利塞膦酸對硅酸鈣骨水泥材料性能的影響及其體外緩釋的機(jī)理。方法 將不同濃度的利塞膦酸(0.1%、0.5%和1.0%)與硅酸鈣骨水泥粉末混合后進(jìn)行水化反應(yīng)，觀察骨水泥固化時(shí)間及3天和7天后的抗壓強(qiáng)度，并利用X射線衍射儀和Rietveld數(shù)字模擬精修方法定性與定量分析水化后骨水泥的相組成。同時(shí)，將固化后載藥骨水泥樣本放入磷酸鹽緩沖液中，利用高效液相色譜儀檢測利塞膦酸28天內(nèi)的釋放曲線。結(jié)果 固化速度及3天和7天后力學(xué)強(qiáng)度均受到利塞膦酸的影響，且隨著利塞膦酸含量的增加，固化速度減慢，力學(xué)性能下降。X射線衍射的定性分析與Rietveld定量分析表明，利塞膦酸強(qiáng)有力附著在硅酸鈣水化后產(chǎn)物硅酸鈣水凝膠表面，阻礙水化反應(yīng)進(jìn)一步發(fā)生，從而延長固化時(shí)間并減少骨水泥的力學(xué)強(qiáng)度。體外藥物釋放曲線表明，利塞膦酸在浸泡后2周內(nèi)達(dá)到釋放峰值，在其后的14天中，并無明顯釋放，證明硅酸鈣骨水泥作為利塞膦酸載藥系統(tǒng)具有緩釋及控釋的效果。吸附與脫附實(shí)驗(yàn)及Higuchi方程分析表明，利塞膦酸在水化時(shí)形成不溶性鈣鹽，因此藥物釋放速度受到制約。結(jié)論硅酸鈣骨水泥作為利塞膦酸緩釋系統(tǒng)具有緩釋和控釋的效果，有利于合并骨質(zhì)疏松癥患者的骨折修復(fù)與重鑄。

硅酸鈣骨水泥；利塞膦酸；骨質(zhì)疏松；藥物緩釋；

引言

硅酸鈣骨水泥(calcium silicate cement,CSC)作為一種齒科修復(fù)材料已經(jīng)得到較廣泛的臨床應(yīng)用，其生物活性主要源于可釋放的硅離子促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，并影響與其相關(guān)的基因表達(dá)[1，2]。若將其作為可降解骨修復(fù)材料，CSC良好的生物相容性和生物活性將會加速破損骨的修復(fù)過程，并在整個(gè)修復(fù)過程中提供足夠的力學(xué)支撐。對于老年合并骨質(zhì)疏松癥的骨折患者，應(yīng)用CSC修復(fù)骨折時(shí)在其中加入適量的利塞膦酸(Risedronate)，則能夠有效地抑制破骨細(xì)胞的活性，減少骨質(zhì)疏松對骨的破壞，從而增強(qiáng)骨水泥對破損骨骼的修復(fù)能力[3]。本文研究了不同含量的利塞膦酸對CSC材料性能的影響以及利塞膦酸在CSC中的緩釋機(jī)理，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 加載利塞膦酸CSC的制備及其材料性能分析

1.1.1 CSC骨水泥的制備

將質(zhì)量百分比為0.1%、0.5%、1.0%的利塞膦酸鈉(Beta Pharma Inc.,Branford,USA)與硅酸鈣粉末均勻混合，分別編號為R01CSC、R05CSC和R10CSC。無添加利塞膦酸鈉的骨水泥為參照（CSC）。硅酸鈣骨水泥粉末主要由硅酸二鈣與硅酸三鈣按質(zhì)量比1:1配比組成。骨水泥水化反應(yīng)按水泥與水比例2:1均勻混合。

1.1.2 固化時(shí)間與抗壓強(qiáng)度的測試

將均勻混合的骨水泥膏體注入17mm×2mm(直徑×高度)的模具中后，將整個(gè)模具放置37℃、相對濕度100%的環(huán)境中靜置30分鐘。骨水泥固化時(shí)間按照ASTM標(biāo)準(zhǔn)測定。將直徑為1mm、重7.8g的探針靜置在固化后骨水泥樣品上表面，約1～2秒鐘后將探針移除。如果上表面無明顯壓痕，則可認(rèn)為水泥已固化完成。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)4次。在抗壓強(qiáng)度的測試中，將均勻混合的骨水泥膏體注入6mm×12mm的模具中,再將整個(gè)模具置于37℃、相對濕度100%的環(huán)境中3天和7天?？箟簭?qiáng)度測試由INSTRON 3369(GroveCity,PA,USA)完成。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)10次。

1.1.3 骨水泥晶體結(jié)構(gòu)分析

由于CSC水化過程中產(chǎn)生硅酸鈣水凝膠與氫氧化鈣，X射線衍射儀(MultiFlex,Rigaku,Japan;source Cu-Ka,40 kV,20 mA)用于定性分析固化后骨水泥中氫氧化鈣的相對含量，從而間接判斷CSC水化反應(yīng)程度。X射線以每分鐘2度的速度在10～60°的范圍內(nèi)掃描。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本重復(fù)4次。Rietveld數(shù)字精修用于定量分析固化后骨水泥中各個(gè)成分的相對含量。將樣本研磨至10 m以下，并以遞進(jìn)式的掃描方式在3～80°的范圍內(nèi)掃描。掃描結(jié)果通過國際衍射中心數(shù)據(jù)庫(PDF -4)及西門子Search-Match軟件分析，并由Topas 4.2完成精修過程。

1.2 利塞膦酸體外釋放機(jī)理

1.2.1 利塞膦酸釋放曲線的檢測

將每一固化3小時(shí)后的骨水泥樣本浸泡在10m l磷酸鹽緩沖溶液中 (pH值=7.4)，分別在12小時(shí)、1、3、7、14、21及28天時(shí)，將原緩沖液與骨水泥樣本分離并在容器中更換緩沖液，通過高效液相色譜儀測定原緩沖液中利塞膦酸的含量。流動(dòng)相由磷酸鹽緩沖液和甲醇按體積比88：12配比而成，流速為1m L/m in，紫外檢測波長為262nm，柱溫控制在25℃。

1.2.2 利塞膦酸在硅酸鈣骨水泥中釋放的動(dòng)力學(xué)研究

將9g固化后的CSC樣本均勻研磨并等分在3個(gè)20m L利塞膦酸飽和溶液中，在25℃環(huán)境下持續(xù)攪拌24、48和72小時(shí)后，高速離心3分鐘，分離上清液。通過高效液相色譜儀測定上清液中利塞膦酸的含量。將分離粉末重新浸泡在10m L不含利塞膦酸的純水中，分別持續(xù)攪拌24、48和72小時(shí)后，分離上清液并再次測定上清液中利塞膦酸含量。利塞膦酸的釋放曲線可以通過3D Higuchi公式來解釋：

式中， 為釋放時(shí)間，D為利塞膦酸在磷酸鹽緩沖液中的擴(kuò)散率，為固化后硅酸鈣骨水泥微氣孔的曲折率，CS為利塞膦酸在磷酸鹽緩沖液中的溶解度，a為固化后硅酸鈣柱體半徑，a0為剩余藥物在柱體中所占半徑，利塞膦酸比重K約等于0.535 cm3/g。()3代表柱體中剩余藥物百分比 (1-%藥物釋放量)。利塞膦酸在磷酸鹽緩沖液中的擴(kuò)散率 (D)可以從Stokes-Einstein方程計(jì)算得出為2.2×10-6cm2/s。微氣孔曲折率 ()可由公式 1/=1-2/3[(1+)(1-)2/3]計(jì)算得出，在硅酸鈣骨水泥體系中可以近似等于3。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

IBM SPSS Statistical software v.19.0(SPSS,Chicago, IL,USA)在本實(shí)驗(yàn)用來統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)的形式給出。單向方差分析 (one-way ANOVA)用來比較各組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。

2 結(jié)果

2.1 利塞膦酸對硅酸鈣骨水泥材料性能的影響

如表1所示，骨水泥固化時(shí)間和抗壓強(qiáng)度均受到利塞膦酸的影響，當(dāng)利塞膦酸含量高于0.5%時(shí)，影響尤其顯著。

表1 骨水泥固化時(shí)間與固化3天及7天后抗壓強(qiáng)度

含有1.0%利塞膦酸的骨水泥固化時(shí)間大約是不含藥樣品的兩倍，而其抗壓強(qiáng)度顯著低于不含藥樣本 (<1MPa)。0.1%的利塞膦酸對骨水泥的影響可以忽略不計(jì)。由此可見，利塞膦酸對骨水泥固化和強(qiáng)度的影響與利塞膦酸濃度存在一定的關(guān)系，濃度越高，影響越明顯。X射線衍射分析(圖1)和Rietveld數(shù)字精修 (表2)進(jìn)一步揭示了利塞膦酸對硅酸鈣骨水泥固化及性能的影響。硅酸鈣水化反應(yīng)產(chǎn)生硅酸鈣水凝膠 (CSH-gel)和氫氧化鈣 (Ca(OH)2)。氫氧化鈣的晶體結(jié)構(gòu)相對于硅酸鈣水凝膠的晶體結(jié)構(gòu)更單一，因此更容易出現(xiàn)在X射線衍射圖譜中。如表2所示，氫氧化鈣含量隨著利塞膦酸含量的增加而降低，表明利塞膦酸阻礙硅酸鈣水凝膠的形成。而硅酸鈣骨水泥固化與其力學(xué)性能主要由結(jié)晶后的硅酸鈣水凝膠提供。Rietveld數(shù)字精修進(jìn)一步證明，在高利塞膦酸含量的水泥樣本中，硅酸鈣水凝膠的形成被明顯阻礙。

圖1 水化7天后，4種樣本X光衍射圖譜

表2 Rietveld數(shù)字精修固化后骨水泥中各晶相含量百分比

2.2 藥物釋放動(dòng)力學(xué)的研究

前期實(shí)驗(yàn)證明利塞膦酸在硅酸鈣骨水泥固化過程中，與鈣離子緊密結(jié)合，形成不溶性的鈣鹽[4]。因此，真正在骨水泥中釋放的不是利塞膦酸，而是結(jié)合二價(jià)鈣離子后的不溶性鈣鹽。這些鹽類的溶解度明顯低于利塞膦酸的溶解度，因此過低的溶解度減慢了利塞膦酸從骨水泥中的釋放，達(dá)到了一種緩釋、控釋的效果。為了使用Higuchi方程來分析釋放曲線，我們通過高效液相色譜測得鈣鹽的溶解度僅為2.3×10-4g/m L等于7.165×10-4M。如圖2所示，利塞膦酸的釋放主要集中在浸泡的前7天，在第7天時(shí)可以近似累積釋放達(dá)到峰值，而后至28天時(shí)釋放速度明顯減慢，可以忽略不計(jì)。而通過Higuchi方程計(jì)算得到的釋放曲線表明，釋放伴隨著時(shí)間而增加，在一個(gè)月后仍有利塞膦酸從骨水泥中釋放。在表3中可以發(fā)現(xiàn)，利塞膦酸對硅酸鈣骨水泥有很強(qiáng)的吸附作用，一旦利塞膦酸結(jié)合鈣離子，所形成的鈣鹽不會輕易溶解。

圖2 含有利塞膦酸骨水泥樣本在磷酸鹽緩沖液中釋放28天釋放曲線

表3 固化后骨水泥粉末在利塞膦酸飽和溶液0、24、48及72小時(shí)后，液體中利塞膦酸含量

3 討論

固化時(shí)間和抗壓強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，由于利塞膦酸能夠強(qiáng)有力結(jié)合鈣離子并顯著影響硅酸鈣骨水泥的水化機(jī)理。然而，通過我們的觀察發(fā)現(xiàn)，在低濃度時(shí) (比如0.1%)，利塞膦酸的影響并不明顯；而當(dāng)濃度高于0.5%時(shí)，影響顯著加強(qiáng)。X射線衍射及Rietveld數(shù)字精修結(jié)果表明，利塞膦酸阻礙硅酸鈣水凝膠的合成，從而延長了固化時(shí)間，并降低了骨水泥的力學(xué)性能。吸附與脫附實(shí)驗(yàn)證明，硅酸鈣與利塞膦酸根發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，結(jié)合成不溶性的鈣鹽(Ca2C7H9NO7P2)[5，6]。在24小時(shí)之內(nèi)，飽和溶液中的利塞膦酸根完全與浸泡在溶液中的硅酸鈣水凝膠結(jié)合，形成利塞膦酸鈣。

高效液相色譜檢測利塞膦酸鈣的釋放曲線與先前其他研究數(shù)據(jù)類似[7，8]。由于骨質(zhì)疏松癥是一種慢性疾病，需要長期治療，這種緩釋特征有利于在長時(shí)間保持治療效果并加速新生骨骼的生長。在本研究中，硅酸鈣水泥的微氣孔曲折率可以近似等于3。將曲折率、溶解度和擴(kuò)散率帶入 Higuchi方程中，會得到一條理論釋放曲線。而這條曲線表明利塞膦酸鈣的釋放隨著時(shí)間而增加，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖。Higuchi方程假定藥物數(shù)量充足并可以連續(xù)溶解，但實(shí)際上利塞膦酸鈣的溶解度僅為2.3×10-4g/m L，意味著利塞膦酸鈣的釋放受到其溶解度的制約。吸附與脫附實(shí)驗(yàn)表明，利塞膦酸鈣在硅酸鈣水凝膠表面形成穩(wěn)定的化合鍵，而這種化合鍵的破裂可以解釋為緩沖液中磷酸根離子與利塞膦酸鈣中雙膦酸根發(fā)生替換反應(yīng)，從而促使在表面的利塞膦酸鈣溶解在緩沖液中。從圖2中看出，藥物累積釋放量在7天后達(dá)到峰值，說明絕大多數(shù)利塞膦酸由于骨水泥包裹，無法發(fā)生離子替換從而溶解[9]。因此，Higuchi方程在7天之內(nèi)可以準(zhǔn)確預(yù)測利塞膦酸在硅酸鈣骨水泥中的釋放過程，而后利塞膦酸的釋放曲線將受到硅酸鈣骨水泥體內(nèi)降解速率的控制。由于硅酸鈣骨水泥的生物降解比較緩慢(0.5～1年)，因此這種藥物釋放系統(tǒng)非常有利于修復(fù)合并骨質(zhì)疏松的骨折與缺損(如高齡股骨粗隆間骨折、橈骨遠(yuǎn)端骨折等)[10]。

利塞膦酸對硅酸鈣骨水泥的固化時(shí)間和抗壓強(qiáng)度均有影響，而且隨著利塞膦酸濃度的提高而加強(qiáng)。這主要是由于利塞膦酸與硅酸鈣水凝膠中的鈣相結(jié)合，從而阻止硅酸鈣水化反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生。所生成的不溶性利塞膦酸鈣強(qiáng)有力的附著在水凝膠的表面，從而減慢了利塞膦酸由硅酸鈣骨水泥中的釋放。從長期效果的角度來看，與傳統(tǒng)的CPC相比，這種緩釋效果更有利于合并骨質(zhì)疏松癥患者的治療，能夠長期提供足夠的力學(xué)支持，從而改善患者的臨床預(yù)后。其作為生物醫(yī)學(xué)骨組織修復(fù)材料具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

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Effects of risedronate on calcium silicate cement material properties and its in vitro drug release mechanism

Gong Tianxing,Zhang Yan,Chen Yadong,et al.Northeastern University Sino-Dutch Biomedical and Information Engineering School,Shenyang Liaoning,110169,China

Objective The effects of risedronate on calcium silicate cement(CSC)material properties and in vitro drug release mechanism were investigated.Methods CSC mixed with 0.1%,0.5%and 1.0%of risedronate was allowed to hydrate.Setting time,3-day and 7-day compressive strength of the CSC was tested.X-ray diffraction and Rietveld refinement were performed to analyze compositional difference in both qualitative and quantitative ways.In addition,High performance liquid chromatography was used to analyze risedronate release profiles up to 28 days in phosphate buffer solution.Results Both setting time and compressive strength were affected by risedronate in a concentration-dependent manner.X-ray diffraction and Rietveld refinement revealed that risedronate was progressively adsorbed onto CSH gel,preventing further hydration of calcium silicate.Drug release profiles demonstrated that there was a burst in release concentration within the first2weeks,and,in the following 14 days,drug release reached a pseudo-steady state,implying that CSC as a potential drug delivery system of risedronate is controllable and sustainable.It was also found that risedronate release from CSC was degradation-controlled instead of diffusion-controlled.Conclusion CSC as a risedronate drug delivery system is controllable and beneficial to bone fractured patients caused by osteoporosis.

Bone cement;Risedronate;Bone fracture;Drug delivery;Biodegradation;In vitro test

R3I8.08

A

鞏天星(1985-)男，博士，副教授。研究方向:生物骨材料開發(fā)與應(yīng)用。應(yīng)用3D打印技術(shù)，快速實(shí)現(xiàn)CAI/CAD/CAM個(gè)性定制化人造骨骼替代物，并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品向臨床應(yīng)用上的轉(zhuǎn)化。(

2014-11-19)

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.02.001

swgk2014-11-0216

東北大學(xué)中荷生物醫(yī)學(xué)與信息工程學(xué)院，遼寧沈陽110169