酸催化水解阿拉伯膠制備L-阿拉伯糖工藝

黃敏慧，鮑宗必，段舒然，邢華斌，楊亦文，任其龍

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310027）

引 言

L-阿拉伯糖[1-2]（L-arabinose, C5H10O5）屬于五碳醛糖，是一種重要的醫(yī)藥中間體，可用于合成阿糖胞苷[3]、L-核糖[4-8]等抗癌、抗病毒和治療心血管疾病的藥物，且可用于細(xì)菌培養(yǎng)基及香料的制備等。近年來，研究表明L-阿拉伯糖還可非競爭性抑制蔗糖吸收所引起的血清葡萄糖濃度升高[9]，顯示它在減肥、預(yù)防糖尿病等方面有廣闊的應(yīng)用前景。L-阿拉伯糖現(xiàn)已被美國 FDA和日本厚生省批準(zhǔn)列入健康食品添加劑，美國醫(yī)療協(xié)會也將L-阿拉伯糖列入非處方藥和抗肥胖劑的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。L-阿拉伯糖在醫(yī)藥、食品行業(yè)的市場潛力巨大。

天然的 L-阿拉伯糖通常以半纖維素 L-阿拉伯聚糖和 L-阿拉伯聚糖-D-半乳糖的形式存在于植物中[10]。其中，阿拉伯膠含有高達(dá)30%以上的L-阿拉伯糖單體[11]，且其他非糖成分含量低，因此阿拉伯膠是制備阿拉伯糖的理想原料。目前，L-阿拉伯糖的提取方法主要有酸堿水解[3,12-15]和酶解法[7,16-18]。其中，酸水解制備工藝的成本較低，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)[19]，但如何優(yōu)化酸水解條件使水解液中 L-阿拉伯糖的含量和收率均達(dá)到最佳水平，是保證后續(xù)分離純化工藝穩(wěn)定性及產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。

本文以工業(yè)級阿拉伯膠為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了一系列影響阿拉伯膠酸水解提取 L-阿拉伯糖的工藝參數(shù)，找到相對較佳的水解條件，為后續(xù)分離提純工藝的過程設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

工業(yè)級阿拉伯膠購買于山東泰安鼎力膠業(yè)有限公司，50%發(fā)煙濃硫酸購于上海振興化工二廠有限公司，氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，L-阿拉伯糖（C5H10O5，99%）、D-半乳糖（C6H12O6，99%）和 L-鼠李糖（C6H12O5·H2O，99%）標(biāo)準(zhǔn)品購于Aladdin公司，色譜純乙腈購于德國Merck公司，水為二次蒸餾水。

1.2 分析方法建立

采用美國戴安D3000高效液相色譜儀建立液相分析方法，檢測器為電噴霧化學(xué)檢測器（CAD）；色譜柱為 GRACE Prevail Carbohydrate ES（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；進(jìn)液量 5 μl；流動(dòng)相為乙腈-水（體積比3:1）；流速1 ml·min?1；柱溫30℃。

1.3 水解實(shí)驗(yàn)

1.3.1 硫酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制 取50 ml 50%發(fā)煙硫酸稀釋至1 L，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定，稀釋后的硫酸濃度約為1 mol·L?1，以此硫酸溶液作為酸催化劑。

1.3.2 水解反應(yīng) 在 250 ml三口燒瓶中加入適量水，加熱至設(shè)定溫度，再加入所需量的阿拉伯膠，磁力攪拌至完全溶解后加入一定體積經(jīng)預(yù)熱的硫酸標(biāo)準(zhǔn)試液，從加入硫酸開始計(jì)時(shí)，每隔10～30 min取樣，樣品稀釋至線性濃度范圍，采用HPLC對各單糖濃度進(jìn)行測定。分別考察了以下不同因素對水解的影響。

（1）反應(yīng)時(shí)間的影響 以90℃、0.1 mol·L?1H2SO4、固液比的質(zhì)量體積比1:10為水解條件，從加入硫酸母液開始計(jì)時(shí)，每隔10～30 min取樣，稀釋至線性范圍后，采用HPLC法對各單糖濃度進(jìn)行測定。

（2）水解pH的影響 通過加入不同體積的硫酸標(biāo)準(zhǔn)液使水解原料液中硫酸濃度控制在0.3、0.2、0.1、0.05 mol·L?1。其余水解條件：T=90℃，固液比為1:10。

（3）溫度的影響 考察了 60～100℃反應(yīng)溫度的水解情況。其余水解條件為：0.1 mol·L?1H2SO4，固液比為1:10。

（4）固液比的影響 通過加入不同量的阿拉伯膠，且控制水解原料液體積為100 ml，考察固液比分別為1:10、1:8和1:5的水解情況。其余水解條件：0.05 mol·L?1H2SO4，T=100℃。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 阿拉伯膠中各單糖含量的測定

取10 g阿拉伯膠在0.3 mol·L?1H2SO4、固液比為1:10、T=100℃的條件下水解12 h至3種單糖濃度均趨于平衡。反應(yīng)結(jié)束后，量取水解液體積105 ml，取樣分析可知L-阿拉伯糖、D-半乳糖和L-鼠李糖的終了濃度分別為40、20、7 g·L?1。由此可知阿拉伯膠中L-阿拉伯糖、D-半乳糖和L-鼠李糖的含量分別為42%、21%和7.35%。

2.2 反應(yīng)時(shí)間對水解情況的影響

固液比為 1:10、T=90℃、H2SO4濃度為 0.1 mol·L?1時(shí)各單糖的濃度及L-阿拉伯糖在三單糖中的相對純度隨水解時(shí)間的變化如圖1和圖2所示。

由圖1可知，在水解100 min內(nèi)，L-阿拉伯糖濃度呈線性趨勢增長，此后增長趨勢減慢直至濃度為36 g·L?1時(shí)趨向平衡，但D-半乳糖在此情況下生成速率緩慢，10 h仍未能水解完全。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，L-鼠李糖在酸加入前的熱溶解過程就已游離，濃度達(dá)1.6 g·L?1且隨反應(yīng)時(shí)間無明顯變化。

在阿拉伯膠的分子結(jié)構(gòu)中，L-鼠李糖以1, 3糖苷鍵與L-阿拉伯糖連接[20]，處于端鏈。在無催化劑存在下加熱至一定程度時(shí)，外界通過加熱提供的能量克服糖苷鍵斷裂所需的活化能，從而使糖苷鍵斷裂而獲得L-鼠李糖，但仍不足以使L-阿拉伯聚糖另一端與D-半乳糖相連的1, 3糖苷鍵斷裂。只有加入一定酸時(shí)，大量的水合氫離子進(jìn)攻糖苷鍵，使得阿拉伯聚糖進(jìn)一步水解，而L-半乳糖處于大分子鏈的中間部分，其糖苷鍵不易受氫離子進(jìn)攻，因此水解速率較慢。

圖2表明，在0～140 min的水解時(shí)間內(nèi)，L-阿拉伯糖相對純度保持增大趨勢，而后水解過程中隨D-半乳糖濃度的增大而逐漸降低。綜合考慮，較佳的水解時(shí)間為180～240 min，此時(shí)L-阿拉伯糖平均濃度為32～33 g·L?1，提取率為80%～82%，相對純度為86.5%～87.5%。

圖1 水解液中L-阿拉伯糖、D-半乳糖和L-鼠李糖濃度隨時(shí)間的變化Fig.1 Concentration profiles of L-arabinose, D-galactose,L-rhamnose in hydrolysate vary with reaction time

圖2 水解液中L-阿拉伯糖的相對純度隨時(shí)間的變化Fig.2 Relative purity of L-arabinose in hydrolysate varies with time

2.3 酸濃度對水解情況的影響

固液比為1:10、T=90℃時(shí)，考察H2SO4濃度在0.05、0.1、0.2 、0.3 mol·L?1時(shí)的水解情況，各單糖的濃度及 L-阿拉伯糖相對純度隨時(shí)間的變化如圖3～圖6所示。

圖3 不同酸濃度下L-阿拉伯糖濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.3 Concentration profiles of L-arabinose in hydrolysate vary with reaction time under different concentrations of sulfur acid

圖4 不同酸濃度下L-阿拉伯糖相對純度隨反應(yīng)時(shí)間變化Fig.4 Relative purity of L-arabinose in hydrolysate vary with reaction time under different concentrations of sulfur acid

圖5 不同酸濃度下D-半乳糖濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.5 Concentration profiles of D-galactose in hydrolysate vary with reaction time under different concentrations of sulfur acid

圖6 不同酸濃度下L-鼠李糖濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.6 Concentration profiles of L-rhamnose in hydrolysate vary with reaction time under different concentrations of sulfur acid

由圖3可知，在0.05～0.2 mol·L?1的酸濃度范圍內(nèi)，L-阿拉伯糖生成速率隨酸濃度增大而增大，當(dāng)酸濃度高于0.2 mol·L?1后無明顯增大趨勢。因?yàn)樗釢舛葹?.2 mol·L?1時(shí)，已有足夠量的氫離子進(jìn)攻 L-阿拉伯聚糖的糖苷鍵，使其以最大速率水解。此外，不同酸濃度催化下，L-阿拉伯糖的水解平衡濃度基本接近，說明在不同酸濃度下，L-阿拉伯糖經(jīng)足夠時(shí)間均能完成水解，最終濃度為36～39 g·L?1。此外，L-阿拉伯糖的相對純度隨 H2SO4濃度增加而有明顯下降。從工業(yè)生產(chǎn)角度而言，較佳水解工藝條件為酸用量低、L-阿拉伯糖生成速率快、相對含量高且維持在較寬的時(shí)間范圍。從圖4可知，0.1 mol·L?1H2SO4為較佳酸濃度，L-阿拉伯糖的相對純度于100～200 min內(nèi)維持約為88%的較高水平。

如圖5所示，D-半乳糖生成速率受H2SO4濃度影響明顯，0.2、0.3 mol·L?1時(shí)顯著大于0.05、0.1 mol·L?1。D-半乳糖濃度在 0.3 mol·L?1水解 11 h時(shí)高達(dá)18 g·L?1，但仍未達(dá)平衡。因?yàn)镈-半乳糖處于阿拉伯膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中間主鏈上，pH增大時(shí)，更多量的水合氫離子進(jìn)攻糖苷鍵，有利于D-半乳糖的生成，但D-半乳糖作為后續(xù)純化工藝中最難分離的雜質(zhì)，含量應(yīng)越低越好。圖6表明L-鼠李糖在酸催化劑加入前已大量水解，而濃度隨酸性增加而略為增加，說明酸的加入使L-鼠李糖水解更充分。

上述結(jié)果表明：酸的加入有利于L-阿拉伯糖和D-半乳糖從阿拉伯膠中水解獲得。綜上所述，當(dāng)H2SO4為 0.1 mol·L?1時(shí)，D-半乳糖水解量較少，此時(shí)的水解液便于工藝后續(xù)分離，且L-阿拉伯糖的水解率較高。

2.4 反應(yīng)溫度對水解情況的影響

取 H2SO4濃度為 0.1 mol·L?1、固液比為 1:10，比較溫度對各單糖生成速率的影響。結(jié)果如圖 7～圖10所示。

圖7 不同溫度下L-阿拉伯糖濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.7 Concentration profiles of L-arabinose in hydrolysate vary with reaction time under different temperature

圖8 不同溫度下L-阿拉伯糖相對純度隨反應(yīng)時(shí)間變化Fig.8 Relative purity of L-arabinose in hydrolysate vary with reaction time under different temperature

圖9 不同溫度下D-半乳糖濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.9 Concentration profiles of D-galactose in hydrolysate vary with reaction time under different temperature

圖7表明溫度是水解參數(shù)中的重要影響因素，溫度越高，L-阿拉伯糖生成速率越大。當(dāng)溫度低于80℃時(shí)，L-阿拉伯糖濃度在水解10 h仍未能達(dá)平衡。隨著水解溫度升高，阿拉伯膠大分子鏈的運(yùn)動(dòng)更劇烈，多糖分子擺脫自身分子間的氫鍵作用力后溶解，溶解后的多糖分子更易受水合氫離子進(jìn)攻而水解成單糖，水解速率隨著增大。

由圖8可知，L-阿拉伯糖相對純度在100～200 min時(shí)均可達(dá)85%以上。L-阿拉伯糖濃度在80℃水解300 min和90℃水解140 min均可達(dá)30 g·L?1，相對純度高達(dá)88%，隨后純度無明顯變化。而T=100℃時(shí)，L-阿拉伯糖濃度在水解60 min時(shí)為34 g·L?1，相對純度為86%，而D-半乳糖隨時(shí)間延長而水解更充分，L-阿拉伯糖相對純度在水解10 h后降至60%。

將圖7與圖3對比可知，相比pH，阿拉伯糖的生成速率更易受溫度影響。圖9與圖5對比可知，pH對D-半乳糖生成速率的影響大于溫度。由圖10可知，溫度和pH對L-鼠李糖的生成速率影響較小。

以上現(xiàn)象原因可能是溫度主要影響糖苷鍵的最初斷裂，L-阿拉伯糖主要存在于支鏈中，易在水解初始階段斷裂。氫離子在斷裂發(fā)生后進(jìn)攻聚合度小的主鏈上的糖苷鍵，水解出D-半乳糖。此外，L-鼠李糖與 L-阿拉伯聚糖之間的糖苷鍵易受溫度影響，在較高溫度下即可斷裂得到L-鼠李糖。

圖10 不同溫度下L-鼠李糖濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.10 Concentration profiles of L-rhamnose in hydrolysate vary with reaction time under different temperature

2.5 固液比對水解情況的影響

考察了T=100℃，0.05 mol·L?1H2SO4，固液比分別為1:10、1:8和1:5（固定液體V=100 ml）時(shí)的水解情況，結(jié)果如圖 11、圖 12所示。圖 11為L-阿拉伯糖濃度變化，為增加可對比性，用水解液中 L-阿拉伯糖濃度與阿拉伯膠質(zhì)量的比值隨反應(yīng)時(shí)間的變化作圖。

從圖11可知，L-阿拉伯糖生成速率隨固液比增大而降低，且水解更不充分，當(dāng)固液比為1:5，100 ml水解液中含有3 g·L?1阿拉伯糖，水解率約為71%（以10 g阿拉伯膠含有4.2 g L-阿拉伯糖為基準(zhǔn)）。固液比為1:10時(shí)，100 ml水解液中含有4.2 g·L?1阿拉伯糖，水解率約為 100%。但固液比越小，水解液中L-阿拉伯糖濃度越低，后續(xù)濃縮能耗增大，且提取周期長、生產(chǎn)效率低，因此固液比為1:10時(shí)相對較佳。

經(jīng)上述各影響因素的考察，得到如下適宜的水解條件：0.1 mol·L?1H2SO4、固液比 1:10、90℃下水解200 min左右。此時(shí)水解液中阿拉伯糖相對含量87%，水解率為85%。

圖11 不同固液比下L-阿拉伯糖濃度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.11 Concentration profiles of L-arabinose in hydrolysate vary with reaction time under different liquid-solid ratio

圖12 不同固液比下阿拉伯糖相對純度隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.12 Relative purity of arabinose in hydrolysate vary time under different liquid-solid ratio

3 結(jié) 論

（1）阿拉伯膠水解過程中，L-阿拉伯糖受溫度影響大于酸濃度，當(dāng)溫度達(dá)到80℃以上時(shí)，較低濃度的酸便使其水解充分，但酸的加入是L-阿拉伯糖水解必不可少的因素，L-阿拉伯糖水解完全時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占阿拉伯膠的42%。

（2）L-鼠李糖的濃度受溫度和酸濃度的影響均較小，隨溫度升高和酸濃度的增加，其濃度有小幅度增加，L-鼠李糖水解平衡時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占阿拉伯膠的7%。

（3）D-半乳糖需要加入一定濃度的硫酸后才能順利水解，因?yàn)樵诎⒗z的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，D-半乳糖處于中間主鏈上，pH越大，越多的氫離子左右于糖苷鍵上，有助于D-半乳糖的生成。在所選用反應(yīng)條件中，都未能使D-半乳糖水解達(dá)到平衡，需選用更劇烈的水解條件。

（4）本文得到的較佳的水解條件為：0.1 mol·L?1H2SO4，固液比 1:10，90℃水解 200 min左右，此時(shí)阿拉伯糖濃度為34 g·L?1，L-阿拉伯糖相對含量為87%，阿拉伯糖水解率為85%（以10 g阿拉伯膠含有4.2 g L-阿拉伯糖為基準(zhǔn)）。

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