細(xì)顆粒物PM2.5對(duì)大鼠IL-10、IL-22 表達(dá)的影響及百令膠囊的干預(yù)作用

張寧，田碩，林樺，李萍，牛姝，蘇力，平芬

空氣污染是當(dāng)今人類面臨的問題，也是引起呼吸系統(tǒng)疾病的主要原因之一，其主要原因是現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展和汽車尾氣的過量排放[1]?？諝庵蓄w粒物(particulate matter，PM)分為超細(xì)(≤0.1 μm)、細(xì)(≤2.5 μm)、粗(≤10 μm)及顆粒[2]。由于PM分散均勻，在空氣中停留很長(zhǎng)一段時(shí)間，因此其可滲透到呼吸系統(tǒng)的最深處，此外，由于PM2.5表面積大，它可以與金屬、重金屬、多環(huán)芳烴、類金屬、元素碳、病毒、細(xì)菌、真菌孢子、內(nèi)毒素、水溶性離子鹽等結(jié)合，長(zhǎng)期和短期暴露在PM2.5中與一系列負(fù)面健康后果有關(guān)，包括呼吸系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、生存期的減少，全世界死亡總?cè)藬?shù)約7.6%(4 200萬)與PM2.5接觸有關(guān)[3-5]。

發(fā)酵蟲草菌粉是百令膠囊的主要生物成分，其具有多種藥理作用，已被用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，如咳嗽、氣喘、慢性支氣管炎肺氣腫、肺間質(zhì)纖維化等[6]。同時(shí)也證明其能抑制炎性反應(yīng)，防止許多器官的缺血性損傷[7]。現(xiàn)通過觀察PM 2.5 及百令膠囊對(duì)大鼠血清白介素 10(interleukin，IL-10)、IL-22含量及mRNA水平的影響，進(jìn)一步證實(shí)百令膠囊對(duì)大鼠肺損傷的抗炎作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只清潔級(jí)Wistar雄性大鼠，180～200 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物質(zhì)量合格證：1912162)，研究前1周適應(yīng)動(dòng)物房間條件，動(dòng)物在室溫23～25℃和相對(duì)濕度25%～30%下保持12 h的光/暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)有關(guān)規(guī)定進(jìn)行操作。

1.2 PM2.5懸液配制 2019 年5—8月期間用大流量采樣器采用玻璃纖維濾膜(河北省故城縣環(huán)境檢測(cè)器材廠生產(chǎn))采集大氣PM2.5細(xì)顆粒物。細(xì)顆粒物濾膜剪切成 1 cm×2 cm長(zhǎng)方形小條，置于去離子水中，使用超聲波清洗器(型號(hào):JL-120DT，昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn))洗脫，3 000 r/min離心20 min，4℃冷凍真空干燥，收集粉末留待備用。臨用前，稱取一定重量的PM2.5，用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的 PM2.5混懸液，超聲震蕩混勻，4℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法 2019年9—10月于河北省人民醫(yī)院動(dòng)物研究中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，40只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分籠飼養(yǎng)。分別標(biāo)記為空白對(duì)照組、PM 2.5染毒組及PM2.5+低、中、高劑量百令膠囊給藥組(百令膠囊購自河北省人民醫(yī)院)。PM2.5染毒大鼠通過氣管滴注濃度為10 mg/kg PM2.5混懸液進(jìn)行造模，每3天1次，共染毒 10 次；PM2.5+百令膠囊給藥組：給予百令膠囊灌胃(滴注細(xì)顆粒物期間同時(shí)給予藥物)28 d，灌胃劑量分別為 0.25、0.5、1.0 g/kg。

1.4 標(biāo)本采集 末次染毒24 h后，予大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.30 ml/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈采血，全血以3 000 r/min離心10 min，提取血清，-80℃冰箱保存。處死大鼠后取肺臟，4%多聚甲醛固定右肺下葉組織，石蠟包埋，切片(片厚3～4 μm)，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肺組織炎性病理改變。左下肺組織凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-10、IL-22蛋白 采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)血清IL-10和IL-22蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作(試劑盒購自美國 BG 公司)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)法檢測(cè)大鼠肺組織IL-10、IL-22 mRNA表達(dá) 采用TRNzol總RNA提取試劑(北京天根科技公司生產(chǎn))進(jìn)行樣本RNA提取，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,北京天根科技公司生產(chǎn))進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，IL-10上游引物序列：5’-CTTTAAGGGTTACTTGGGTTGC-3’；下游引物：5’-CCACTGCCTTGCTTTTATTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)200 bp；IL-22上游引物序列：5’-TACTATGGGAGGGTGATG-3’；下游引物：5’-GTTTGGTTTCTATGTGGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)156bp。每個(gè)樣本檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔，數(shù)據(jù)采用2-△△ CT法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化比較 光鏡下，空白對(duì)照組大鼠肺組織未見明顯炎性反應(yīng)；PM2.5染毒組可見大量慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增寬，寬窄不一，肺間質(zhì)內(nèi)血管擴(kuò)張，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出物；高劑量百令膠囊干預(yù)組較PM2.5染毒組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯減輕，低劑量及中劑量百令膠囊干預(yù)組病理表現(xiàn)介于PM2.5染毒組及高劑量百令膠囊干預(yù)組之間，見圖1。

2.2 各組大鼠血清 IL-10、IL-22水平比較 PM2.5染毒組大鼠血清IL-10水平明顯低于空白對(duì)照組(t=27.758，P=0.000)，IL-22水平明顯高于空白對(duì)照組(t=28.190，P=0.000)。與PM2.5染毒組比較，百令膠囊各干預(yù)組隨劑量的增加，血清IL-10水平逐漸升高(F=224.867，P=0.000)，而血清IL-22水平則逐漸下降(F=149.115，P=0.000)，見表 1。Pearson相關(guān)分析表明，血清IL-10 和IL-22水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.960，P<0.01)。

表1 各組大鼠血清IL-10、IL-22水平比較

2.3 各組大鼠肺組織IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)比較 RT-PCR 結(jié)果顯示；PM2.5染毒組大鼠肺組織IL-10 mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(t=61.342，P=0.000)，IL-22水平明顯高于空白對(duì)照組(t=-55.298，P=0.000)。與PM2.5染毒組比較，百令膠囊干預(yù)組隨劑量增高，肺組織IL-10 mRNA表達(dá)升高(F=1 131.931，P=0.000)，IL-22 mRNA水平則呈下降趨勢(shì)(F=604.257，P=0.000)，見表2、圖2。

注：A.空白對(duì)照組;B.PM2.5染毒組;C.低劑量百令膠囊干預(yù)組;D.中劑量百令膠囊干預(yù)組;E.高劑量百令膠囊干預(yù)組圖1 各組大鼠肺組織病理表現(xiàn)(HE染色，×200)

表2 各組大鼠肺組織IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.01；與PM2.5染毒組比較，bP<0.05；與低劑量百令膠囊干預(yù)組比較，cP<0.05；與中劑量百令膠囊干預(yù)組比較，dP<0.05圖2 各組大鼠肺組織IL-10、IL-22 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

顆粒物是大氣污染物的主要組成部分，它可導(dǎo)致急性或慢性呼吸系統(tǒng)疾病，如急性支氣管炎、支氣管哮喘、肺癌等，也可以引發(fā)慢性呼吸系統(tǒng)疾病加重，但其對(duì)人類呼吸系統(tǒng)的毒性影響及確切機(jī)制并不明確[8]。顆?？赡芡ㄟ^提高氣道反應(yīng)性、促進(jìn)氧化應(yīng)激、引起炎性反應(yīng)、降低宿主免疫防御機(jī)制，從而導(dǎo)致肺部疾病的發(fā)生或惡化[9-10]。

百令膠囊是由發(fā)酵冬蟲夏草菌粉組成的人工制劑，與天然蟲草主要成分一致。百令膠囊還富含氨基酸、核苷酸、蟲草酸、蟲草多糖等物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多重作用[11-12]。目前通過體外試驗(yàn)證明，冬蟲夏草是一種免疫調(diào)節(jié)活性成分，可增加抗炎因子的表達(dá)[13-14]。

肺部炎性反應(yīng)是導(dǎo)致肺部疾病(包括肺損傷)發(fā)病的中心效應(yīng)[15]，包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，以及它們釋放的細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α、IL-10等參與炎性反應(yīng)和組織損傷[16]。

IL-10細(xì)胞因子家族包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26，被認(rèn)為是2α螺旋細(xì)胞因子。其中IL-10是最重要的抑制細(xì)胞因子，可以抑制炎性反應(yīng)、限制過度免疫反應(yīng)[17]。IL-10是NF-κB的一種強(qiáng)有力的抑制劑，其抗炎活性主要是通過這種方式介導(dǎo)的，另外，STAT 1/SOCS-3信號(hào)通路的激活是IL-10的另一抗炎機(jī)制[18]。本研究結(jié)果提示，PM2.5染毒組IL-10水平明顯低于空白對(duì)照組，百令膠囊干預(yù)組IL-10水平明顯高于PM2.5染毒組，提示百令膠囊可能通過上調(diào)IL-10減輕PM2.5導(dǎo)致的炎性反應(yīng)。

IL-22是新近報(bào)道的IL-10細(xì)胞因子家族中的一員，IL-22與IL-10結(jié)構(gòu)相似，兩者共用IL-10R2鏈，CD4+T輔助細(xì)胞、γδT細(xì)胞、自然殺傷(NK)T細(xì)胞和第3組固有淋巴樣細(xì)胞(ILC 3)通常是IL-22的主要細(xì)胞來源[19]。IL-22的表達(dá)具有異質(zhì)性，Starkey等[20]發(fā)現(xiàn)輕度至中度COPD患者氣道上皮細(xì)胞中IL-22和IL-22RmRNA的表達(dá)增加，而在重度COPD患者中無明顯變化。IL-22在哮喘中具有雙重作用，它能在臨床前模型中促進(jìn)哮喘的發(fā)生，但能減輕抗原抗體免疫反應(yīng)和惡化時(shí)的炎性反應(yīng)[21]。IL-22的雙向作用，取決于細(xì)胞因子環(huán)境或者疾病的病理狀態(tài)，主要通過STAT3信號(hào)途徑發(fā)揮生物學(xué)作用[22]，本研究發(fā)現(xiàn)，IL-22在PM2.5染毒組中明顯升高，中、高劑量百令膠囊干預(yù)組IL-22 水平明顯低于MP2.5染毒組，提示百令膠囊可能通過下調(diào)IL-22來拮抗PM2.5導(dǎo)致的肺損傷。

本研究結(jié)果表明，PM2.5可導(dǎo)致肺部炎性反應(yīng)，而IL-10及IL-22分別是PM2.5介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要抗炎介質(zhì)及炎性介質(zhì)，兩者具有相反的生物學(xué)活性，百令膠囊可能通過促進(jìn)IL-10的分泌，以及抑制IL-22的生成，對(duì)肺部起到保護(hù)作用，但是其中機(jī)制，尚需未來進(jìn)一步的深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張寧：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；田碩、牛姝：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改;林樺、李萍：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;蘇力：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;平芬：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫