豬流行性腹瀉病毒流行毒株S基因的遺傳變異和B 細胞線性抗原表位分析

程小娜，張 志，樊雅婷，劉自立，吳發(fā)興，劉 爽，董雅琴，邵衛(wèi)星，楊雨輝，王樹雙，李曉成＊

（1.海南大學(xué)，海南海口 570228；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201）

豬 流 行 性 腹 瀉 （Porcine epidemic diarrhea，PED）是以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病，在我國豬場大規(guī)模暴發(fā)和流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的損失，其病原主要是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）［1-3］。PEDV 屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒粒子呈多形性，其基因組為單股正鏈RNA，大小約28ku［4］。病毒基因組主要編碼多聚酶蛋白（rab）、纖突蛋白（S）、ORF3蛋白、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核蛋白（N）等，其中，S蛋白由1 383個氨基酸組成［5］，是病毒的囊膜結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒與受體細胞結(jié)合吸附、膜融合等方面發(fā)揮重要作用，也是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性中和抗體的主要免疫蛋白。盡管PEDV的S基因沒有酶裂解位點，但根據(jù)其他冠狀病毒S蛋白序列可以將PEDV S蛋白人為地劃分為S1區(qū)（1-789位氨基酸）和S2區(qū)（790-1 383位氨基酸）；S1可識別受體，S2負責(zé)病毒囊膜與宿主細胞膜融合［6］。由于受到宿主免疫選擇的壓力和病毒自身進化的需要，S蛋白易發(fā)生變異，因此S基因常被用來研究PEDV不同毒株的遺傳演化規(guī)律［7-9］。2014年，本課題組對山東、河北等地發(fā)生流行性腹瀉的豬場開展了流行病調(diào)查和監(jiān)測，從中分離和鑒定了數(shù)株P(guān)EDV流行毒株，為進一步研究這些毒株流行特點，對這些毒株的S基因進行了克隆測序和分析，并對其抗原性和B細胞線性表位進行了深入分析，為更深入了解PEDV流行毒株的分子流行病學(xué)積累了資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 4份PEDV 流行毒株SDZB01、SDZB02、SDZY03和HB04，采集和分離自山東和河北3個發(fā)病豬場的小腸及糞便樣品，這3個豬場的仔豬均發(fā)生嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和死亡等癥狀，經(jīng)中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心畜病檢測室鑒定和分離后制備和保存。

1.1.2 材料 Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；RTPCR一步法擴增試劑盒、膠回收試劑盒、克隆載體PMD18-T easy Vector、DH5α感受態(tài)細胞等為大連Takara公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 取發(fā)病仔豬的糞便樣品或細胞培養(yǎng)物，按照Trizol試劑盒說明書提取病毒的RNA，純化后的RNA用20μL DEPC處理水溶解，置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PEDV的S基因擴增和測序 以GenBank中登錄的PEDV毒株CH／GDGZ／2012（KF384500）的S基因序列作為參考序列，將整個S基因分為S1、S2、S3三段進行擴增，利用 DNA Star中的Primer Select軟件，分別設(shè)計3對引物S-F1／S-R1、S-F2／S-R2和S-F3／S-F3。引物序列和位置見表1，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 PEDV S基因的擴增引物序列Table 1 Primer sequences for amplification on S gene of PEDV

1.2.3 S1、S2、S3片段的PCR擴增與克隆 以提取的樣品 RNA 為模板，以S-F1／S-R1、S-F2／S-R2、S-F3／S-F3為引物進行PCR，反應(yīng)條件為：S-F1／SR1：42℃1h；94℃5min；94℃40s，50.5℃40s，72℃2min 30s，35個循環(huán)；72℃10min。S-F2／SR2：42℃1h；94℃5min；94℃40s，60.5℃40s，72℃1min 50s，35個循環(huán)；72℃10min；擴增 F3片段的退火溫度為57℃，其他擴增條件均與F2片段相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收與PMD18-T Vector載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后挑取單個菌落進行PCR鑒定，重組質(zhì)粒由寶生物工程（大連）有限公司進行測序。

1.2.4 序列分析 采用 DNA Star軟件對4株P(guān)EDV野毒株的S基因進行拼接接和同源性分析，用CLUSTAL1.83軟件和 MEGA6構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)生樹，用DNA Star中Jameson-Wolf法分析野毒株和疫苗株CV777的抗原性，用BepiPred 1.0Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／BepiPred／）分析B細胞線性抗原表位，PEDV參考序列為Gen-Bank中所有已發(fā)表S全基因的序列（截止2014年11月20日），分別來自我國、韓國、美國、日本、加拿大等國2004年-2014年度毒株，共178株，以及CV777、DR13和KPEDV-9等3株疫苗參考序列。

2 結(jié)果

2.1 PEDV流行毒株S基因的擴增和測序

以病料樣品制備的總RNA為模板用一步法擴增S1、S2、S3三段S基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析?？梢钥匆姷礁?條分別為1.8、1.6、1.4kb的條帶（圖1），其大小與預(yù)期相符。將4個PEDV流行毒株分別擴增出PEDV S1、S2、S3三段基因的12份陽性克隆菌液送樣進行測序，用Seqman拼接后分別命名這4個PEDV流行毒株為SDZB01／2014、SDZB02／20l4、SDZY03／2014、HB04／2014。4株P(guān)EDV S基因全長分別為4 158、4 158、4 161和4 161個核苷酸，分別編碼1 386、1 385、1 387和1 387個氨基酸。

圖1 連續(xù)RT-PCR法擴增全長S基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Continuous amplification of spike gene from PEDV field strains by RT-PCR

2.2 S基因進化樹分析

MEGA分析顯示，PEDV毒株可以分為G1和G2兩個大的進化分支，在分析的185株P(guān)EDV中，G1分支包括32株P(guān)EDV，占總毒株的17.3%，G2分支含153株P(guān)EDV，占總毒株數(shù)的82.7%，也是近年P(guān)EDV主要的流行優(yōu)勢分支。G1群可以分為G1.1和 G1.2等2個次分支，其中，G1.1 含有CV777、DR13、KPEDV等疫苗株、我國部分毒株及日本分離株（MK），G1.2分支含有8株我國2011年流行毒株、1株2012年流行毒株、1株2004年毒株（JS-2004）2013年-2014年美國和加拿大流行毒株。G2群可分為G2.1、G2.2和G2.3等次分支，G2.1為韓國和日本2011年-2012年流行毒株，G2.1中的G2.1a分支中的毒株為韓國和日本2011年-2012年流行毒株，而且韓國和日本流行的毒株均各自成簇，G2.1b中的毒株全部為韓國2011年流行毒株；G2.2分支由我國部分2011年-2013年分離毒株組成，分別來自我國的河北、廣東、廣西、河南等省份，我們此次鑒定的4株毒株中的2株（SDZB01和SDZB02）也位于此進化分支內(nèi)；另一個流行分支是G2.3分支，它包含大多數(shù)PEDV流行毒株，包括中國2011年-2014年不同省份的毒株，本次的2個流行毒株（SDZY03和HB04），以及美國和韓國近2年的毒株，而且美國和韓國毒株的流行毒株均屬于同一個小分支（圖2）。

圖2 PEDV的同源進化樹Fig.2 Phylogenetic trees constructed by spike protein of PEDV field strains

2.3 S基因同源性分析

Megalign軟件分析可知，SDZB01、SDZB02與SDZY03和HB04的同源性為97.5%～97.6%，相互之間的同源性為99.9%。SDZB01、SDZB02與G1群的同源性為92.4%～94.9%，參考病毒株CV777、DR13、KPEDV-9、83P-5（100th）等的同源性為92.4%～93.1%，SDZY03和HB04與與G1群的同源性為92.5%～95.6%，與參考病毒株CV777、DR13、KPEDV-9、83P-5（100th）等的同源性為92.5%～93.3%。SDZB01、SDZB02與 G2分支內(nèi)其他他毒株的同源性分別為96.1%～99.9%，與近兩年出現(xiàn)的美國毒株Iowa103-2013、Ohio120-2014的同源性分別為97.8%～97.9%。SDZY03和HB04與與G2分支內(nèi)其他他毒株的同源性分別為96.5%～99.9%，與近兩年出現(xiàn)的美國毒株Iowa103-2013、Ohio120-2014的同源性分別為99.1%～99.2%。

與參考病毒株CV777相比，流行毒株存在2個插入突變和1個缺失突變，插入的部位在流行毒株的59-62（GENQ）、140（N），缺失突變位于163-164（NI），除此之外，野毒株的多個氨基酸位點還存在堿基替換，如27-29位（QST→SAN）、64（S→T）、68-72（GTGIE→AGQHP）、84（Y→H）、86～87（DS→RG）、89（Q→H）、120（I→T）、130-131（DN→SI）、159-164（QDGKNI→SEHS）、178（A→S）、186（I→F）、196（R→K）、200-202（SGG→KRS）、209（E→T）、227-229（SYQ→YYE）、246（EP→DS）、270（V→L）等。

2.4 抗原性分析

用DNA Star中的Protean軟件分析PEDV流行毒株SDZB01和疫苗株CV777，SDZB01等野毒株的抗原區(qū)域明顯增多的區(qū)域為：25-95、250-275、370-380、990-1 030、1 180-1 260等，其他區(qū)域的抗原性與疫苗株類似，詳見圖3。

圖3 CV777和SDZB01毒株S基因的抗原性分析Fig.3 Antigenicity of spike genes of CV777and SDZB01strains

2.5 S基因的B細胞線性表位分析

使用 BepiPred 1.0Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／BepiPred／）軟件對 PEDV 流行毒株SDZB01和疫苗毒株CV777等毒株進行分析，軟件的Threshold取值為0.35，其敏感性為0.49，特異性為0.75。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該毒株SDZB01的線性B細胞抗原表位有34個（threshod值＞0.35），分布區(qū)段分別 為 22-27、53-62、66-76、96-104、113-120、133-144、168-171、190-200、219-230、242-253、304-317、350-357、428-436、483-500、521-537、561-572、608-612、627-638、676-680、700-710、724-730、738-745、761-785、866-873、883-891、910-925、1 019-1 028、1 041-1 047、1 123-1 138、1 208-1 217、1 235-1 246、1 259-1 266、1 283-1 298、1 370-1 374位氨基酸，其中S1片段有23個，S2片段有11個，這個結(jié)果與S的功能相一致，也進一步證實了S1片段是S基因的主要抗原區(qū)域，35個線性表位中，Threshold最大值超過1.0的線性表位有15個。與參考毒株CV777相比，4個野毒株有6個區(qū)域的Threshold值有明顯差異，其中148-156和346-353兩個區(qū)域的Threshold值比CV777毒株小，而其余區(qū)域的Threshold值都大于CV777毒株，詳見表2和表3。

3 討論

S基因是PEDV主要的抗原決定基因，其基因結(jié)構(gòu)和功能與病毒的感染性、致病性、抗體的產(chǎn)生和細胞結(jié)合能力密切相關(guān)。本文研究發(fā)現(xiàn)，PEDV流行毒株的S基因在進化樹上與CV777、DR13等疫苗株存在明顯區(qū)別，二者之間的同源性也只有92.4%～93.3%，從進化樹上可以看出疫苗株與流行毒株分別位于不同的進化分支，表明PEDV流行毒株已經(jīng)與疫苗株存在較大的變異。

Li Z L等［10］分析了我國南部部分 PEDV 流行株S基因的同源進化樹，他將PEDV分為3個進化分支，G1-G3型，其中G1和G2型實際上與本文的G1群一致，G3型與本文的G2群一致，其研究結(jié)果顯示PEDV的流行毒株均屬于G3群，與本文PEDV流行毒株主要屬于G2型的研究結(jié)果一致。這說明G2群是全球目前PEDV主要的優(yōu)勢流行毒株，該分支既有美國、加拿大、墨西哥等美洲毒株，也有中國、韓國和日本等國的毒株。

從地域上看，PEDV流行毒株具有一定的地區(qū)分布性特點：①除了中國以外的其他國家的流行毒株分布相對集中。不同國家的分離株基本屬于同一個分支，如G1.2、G2.1a、G2.1b和G2.3各分支中韓國和日本等國家的流行毒株都形成一個單獨的進化分支；②中國PEDV流行毒株缺乏地區(qū)性。很多進化分支中既有河北省，也有廣東省，甚至一個省內(nèi)部的分離株也難以形成單獨的進化分支，如本文山東省的3株毒株分布于2個不同的進化分支，其中1株與河北省的1株高度同源。這一結(jié)果提示我國豬群PEDV的發(fā)病和流行可能與我國生豬無序調(diào)運密切相關(guān)，生豬的頻繁調(diào)運增加了生豬之間相互流通的可能性，導(dǎo)致不同的PEDV流行毒株之間相互交叉感染。從時間上看，PEDV毒株沒有見到明顯的時空聚集性，同一個進化分支內(nèi)可以含有不同年代的流行毒株。

表2 CV777的S基因氨基酸位置及相應(yīng)位置的SDZB01毒株的Threshold值Table 2 Different threshold values of S genes from CV777strain and corresponding SDZB01strain at some certain regions

表3 SDZB01與CV777毒株Threshold明顯差異的氨基酸位點及對應(yīng)值Table 3 Significant difference of Threshold values and amino acid sites for S gene from SDZB01and CV777strain

從同源性上看，近年來PEDV的流行毒株與疫苗株的同源性不斷加大，2012年，GDGZ／12毒株與CV777、DR13的氨基酸同源性分別為97.7%和98.0%［11］，而本文的同源性只有92.3%和92.4%，這說明流行毒株不斷和持續(xù)受到疫苗的免疫壓的影響。

從B細胞線性表位上看，與CV777毒株比較，發(fā)現(xiàn)SDZB01有4段B細胞線性表位的Threshold值大于CV777毒株，分別位于52-62、360-365、375-378和752-781等處。特別是52-62位，流行毒株相比CV777插入了4個額外的氨基酸（GENQ），從而增加了一個超強的抗原表位（出現(xiàn)一個7個連續(xù)的Threshold值超過1的氨基酸PTGENQG），這樣一個超強抗原表位的出現(xiàn)必然影響PEDV毒株的許多生物學(xué)特性。長期以來，人們一直想弄清楚PEDV野毒難以培養(yǎng)的機制，現(xiàn)在普遍認為，PEDV受體結(jié)合域是PEDV與感染細胞結(jié)合的部位，其結(jié)構(gòu)的特點決定了病毒的侵染性高低，孫東波等［12］研究認為PEDV毒株CV777的S基因的249-529位氨基酸區(qū)域是PEDV的受體結(jié)合域，本文發(fā)現(xiàn)的另外2個存在差異的抗原表位，即346-353aa和360-365aa，也恰好位于此區(qū)間。對于表位346-365aa來說，SDZB01和SDZB02流行毒株的Threshold值約是疫苗株的2倍，SDZY03和HB04流行毒株甚至是疫苗株的3.5倍；對于表位375-378aa，盡管SDZY03和HB04流行毒株的Threshold值略高于疫苗株，但SDZB01和SDZB02流行毒株的Threshold值仍是疫苗株的2.5倍。這種抗原表位的差異也可能影響PEDV流行毒株與細胞受體的結(jié)合，從而影響其感染性。另外，在對S基因抗原表位的研究中，Sun D B等認為［13-14］，S基因636-789位氨基酸特別是其中的748-755aa和764-771aa還是S基因的2個引起PEDV中和抗體的線性表位，這一結(jié)果與752-781段抗原表位基本一致，在此區(qū)域，盡管野毒株和疫苗株之間只有3個堿基發(fā)生了變異（S→L、S→D、T→M），但其 Threshold值卻由0.655迅速上升到1.235。這種變異是否影響了野毒株的抗原性還有待進一步研究。

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