小反芻獸疫病毒N蛋白B細胞表位預測、合成及間接ELISA方法的建立

曾少靈，阮周曦，唐金明，廖立珊，孫 潔，林慶燕，呂建強，葉奕優(yōu)，祝 賀，李希強，王紅英，楊俊興，花群義＊

（1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳 518045；2.云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，云南昆明 650028；3.內(nèi)蒙古牙克石市動物疫病防控中心，內(nèi)蒙古牙克石 022150）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒 （Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性傳染病，主要感染綿羊和山羊，其中山羊高度易感，野生小反芻獸偶有發(fā)生［1-2］。此病以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征［3］，嚴重暴發(fā)時病死率可高達100%［2，4］。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫?。?-3］。此病2007年首次傳入我國，在西藏地區(qū)發(fā)生并一直流行，之后由邊境逐漸向內(nèi)地傳播［1，5］，至2014年4月大范圍暴發(fā)，已波及超過17個省市地區(qū)［3，5］。目前，PPR已成為威脅我國養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的重要疫病，造成大批羊只死亡，經(jīng)濟損失巨大［3，6］。

PPRV共編碼6種結構蛋白和2種非結構蛋白，其中N蛋白是PPRV結構蛋白中的核衣殼蛋白，具有含量最豐富、免疫原性最強和特異性最好等特點，在病毒感染的動物血清中針對N蛋白的抗體占主導地位［7-10］。本研究通過生物軟件分析獲取PPRV N蛋白的B細胞抗原表位信息，據(jù)此合成了含有特異性抗原表位的人工多肽，并用作包被抗原，建立了PPRV血清抗體間接ELISA方法，對于該病的研究和預防控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人工合成多肽 多肽片段由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心動檢室設計，由上海強耀生物科技有限公司負責合成。

1.1.2 試劑和儀器 山羊小反芻獸疫標準陽性血清和標準陰性血清、山羊牛瘟病毒免疫陽性血清從英國動物衛(wèi)生研究所Pirbright實驗室引進；50份疫區(qū)臨床山羊陽性血清、80份非疫區(qū)山羊陰性血清由西藏出入境檢驗檢疫局技術中心提供；山羊口蹄疫病毒陽性血清、山羊痘病毒陽性血清、山羊棘球蚴陽性血清均為深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心動檢室保存；法國小反芻獸疫標準競爭ELISA檢測試劑盒（CIRAD-BIOS）；兔抗山羊IgGHRP、底物顯色液等試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；I MARK型自動酶標儀；Eppendorf 5415R型高速離心機；CTC-256型恒溫恒濕培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 蛋白序列的獲取 根據(jù)序列號AAS68026.1從GenBank下載獲得PPRV病毒N蛋白氨基酸全序列。

1.2.2 二級結構的分析 綜合采用Gamier-Robson、 Chou-Fasman、 Kyte-Doolittle、 Esenberg、Karplus-Schulz、Jameson-wolf和 Emini 7種預測方法分析PPRV病毒N蛋白的二級結構［11-12］。

1.2.3 B細胞表位的預測 在1.2.2二級結構分析結果基礎上，推斷PPRV病毒N蛋白可能的B細胞表位［11-12］。

1.2.4 多肽的設計和人工合成 基于1.2.3的B細胞表位推斷結果，設計幾段多肽，交付多肽合成上海強耀生物科技有限公司進行人工合成。

1.2.5 利用人工合成多肽建立間接ELISA檢測方法［11，13-16］用pH 9.2的碳酸鹽緩沖液將人工合成的多肽稀釋成一定濃度。在酶標板的每孔內(nèi)加入100μL多肽包被液，于4℃冰箱中包被16h～24h。以PBST洗液清洗3次。每孔加入50g／L的明膠液100μL，37℃下封閉2h。以PBST洗液洗滌3次，備用。分別對小反芻獸疫標準陽性血清和標準陰性血清按1∶25、1∶50、1∶100、1∶200進行稀釋，與小反芻獸疫疫區(qū)臨床山羊陽性血清、非疫區(qū)山羊陰性血清，以及山羊牛瘟病毒超免疫陽性血清、山羊口蹄疫病毒陽性血清、山羊痘病毒陽性血清和山羊棘球蚴陽性血清一起作為待測樣品，采用包被好的ELISA板進行間接ELISA（iELISA）檢測。加入各種血清樣品后，37℃下孵育45min。以PBST洗液洗滌3次。按100μL／孔加入1∶5 000稀釋的兔抗山羊-IgG，37℃下孵育30min。顯色，終止反應，測定OD 450nm的值。使用檢測后確認特異性和敏感性良好的人工多肽包被ELISA板，分批存放在-20℃和4℃，間隔不同時間段，取出用于檢測，測試包被物的穩(wěn)定性。

1.2.6 臨床血清樣本的檢測和與進口試劑盒的符合率試驗 用1.2.5建立的間接ELISA方法和進口的標準小反芻獸疫血清抗體檢測試劑盒同時對小反芻獸疫疫區(qū)臨床山羊陽性血清和非疫區(qū)山羊陰性血清進行檢測，統(tǒng)計兩種方法的檢測符合率。

2 結果

2.1 PPRV N蛋白序列的獲取與初步分析

從GenBank下載獲得PPRV N蛋白氨基酸全序列，序列號為AAS68026.1。利用DNA Star軟件對此序列進行初步分析，推斷N蛋白的B細胞抗原表位可能集中在靠近C-端的由389個氨基酸組成的肽段中，長度約為全蛋白序列的2／3［8，12］。本文作為研究目標的蛋白氨基酸序列如圖1。

圖1 作為本文研究目標的PPRV N蛋白氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequences of N protein in PPRV as a research target in this study

2.2 PPRV N蛋白的二級結構分析結果

以Gamier-Robson、Chou-Fasman、Kyte-Doolittle和Esenberg等分析方法，預測PPRV N蛋白α-螺旋、β-折疊、轉角、無規(guī)則卷曲等結構，以及親水高峰區(qū)、兩親性區(qū)域、柔性區(qū)域、抗原性指數(shù)區(qū)域和表面可及性區(qū)域等二級結構和特殊區(qū)域的位置，結果如圖2所示。當兩種分析方法對同一結構存在的區(qū)域預測結果不一致時，優(yōu)先采用兩種方法均確認的區(qū)域作為該種結構的預測位置。以峰形圖展示的結構分析，均采用峰值大于基線值（0或1）的區(qū)域對應的預測位置。

2.3 PPRV N蛋白的B細胞表位預測結果

綜合2.2的分析結果，選取PPRV N蛋白氨基酸區(qū)段中沒有α-螺旋或β-折疊結構，滿足抗原性指數(shù)≥0、親水性指數(shù)≥0和氨基酸的表面可及性指數(shù)≥1等條件的區(qū)段，在上述區(qū)段的內(nèi)部或附近再尋找具有轉角結構、無規(guī)則卷曲和柔性結構的區(qū)段，最后推斷出N蛋白的抗原表位可能處在蛋白N端77-79、108-111、187-190、191-192、212-213、218-222、223-226、238-240、289-292、294-296、313-316、317-327和384-386位置的氨基酸區(qū)段內(nèi)或附近。

2.4 PPRV N蛋白含B細胞抗原預測表位的人工多肽的設計和合成

在PPRV N蛋白中選取了4個區(qū)段，每個區(qū)段長度約為50個～60個氨基酸，分別包含2.3預測分析得出的B細胞抗原表位，交付專業(yè)公司完成人工多肽的合成。選取的4段人工合成多肽的氨基酸序列及編號分別為：①61-120位氨基酸區(qū)段，編號為PPRVN（61-120），氨基酸序列為 WVKYTQQRRVIGEFRLDKGWLDAVRNRIAEDLSLRRFMVSLILDIKRT PGNKPRIAEMIC；②185-244位氨基酸區(qū)段，編號為PPRV-N（185-244），氨基酸序列為IQNKFSAGAYP LLWSYAMGVGVELENSMGGLNFGRSYFDPAY FRLGQEMVRRSAGKVSSV；③264-323位氨基酸區(qū)段，編號為 PPRV-N（264-323），氨基酸序列為SQTGDERTVRGTGPRQAQVSFLQHKTDEGES PTPATRE EVKAAIPNGSEGRDTKRTRSGK；④306-365位氨基酸區(qū)段，編號為PPRV-N（306-365），氨基酸序列為AIPNGSEGRDTKRTRSGKPR GETPGPLLPEIMQEDELSRESSQNPREAQRSA EALRLQA。

圖2 PPRV病毒N蛋白的二級結構分析結果Fig.2 Analysis results of secondary structures of N protein in PPRV

2.5 PPRV間接ELISA檢測方法的初步建立

2.5.1 人工合成多肽篩選結果 按方法1.2.5，分別以人工合成的4段多肽作為包被物，對血清樣品進行間接ELISA檢測。經(jīng)篩選，確認編號為PPRVN（264-323）和PPRV-N（306-365）兩段多肽與小反芻獸疫病毒標準陽性血清的反應特異性良好，與標準陰性血清、其他幾種常見山羊病陽性血清無交叉反應。與進口標準競爭ELISA試劑盒同時檢測系列稀釋的PPRV標準陽性血清，檢測極限均可達1∶200，表明敏感性相當。做好的包被板在4℃存放，2周內(nèi)使用效果無變化，在-20℃存放，3個月內(nèi)使用效果無變化，表明這兩段多肽作為ELISA包被物穩(wěn)定性良好。

2.5.2 多肽聯(lián)合包被物及陽性血清最佳稀釋度的篩選 本研究選定檢測效果良好的編號為PPRV-N（264-323）和PPRV-N（306-365）兩段多肽作為聯(lián)合包被物，分別以pH 9.2的碳酸鹽緩沖液稀釋成2μg／100μL～0.25μg／100μL包被反應液，兩種多肽以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4多種比例分別混合作為聯(lián)合包被物，血清從1∶25到1∶200倍比稀釋，酶標二抗1∶5 000倍稀釋，與兩組多肽單獨作為包被物的情況進行比對檢測試驗（部分數(shù)據(jù)列于表1，表中的OD值數(shù)據(jù)為多次試驗的平均值）。結果顯示，隨著血清稀釋倍數(shù)的增加和兩種人工多肽抗原包被總濃度的降低，血清的OD值隨之降低，當血清稀釋度在1∶100，兩種多肽按1∶1比例混合成聯(lián)合包被物且總濃度為1μg／100μL濃度時，陽性血清OD值接近于1.0，陰性血清OD值＜0.2，并且陽性和陰性血清OD值的比值（P／N值）為最高，此時多肽聯(lián)合包被物及陽性血清的稀釋度為最佳工作條件。

2.5.3 間接ELISA判定標準的確定 按2.5.2篩選的條件，對小反芻獸疫病毒標準陰性血清和其他幾種山羊病的參考血清進行ELISA檢測，結果表明這些血清樣品的OD值在0.156～0.284之間（具體數(shù)據(jù)略），樣品平均值和標準差分別為＝0.185，SD＝0.038，得到置信區(qū)間上限＋3SD＝0.299≈0.30，將0.30作為陰性血清OD值的上限，根據(jù)統(tǒng)計學原理，當血清樣品OD值＞＋3SD時，可以在99.9%的水平上判定為陽性。因此得出間接ELISA判定標準為，當待測樣品的OD值大于0.30時判為陽性，小于或等于0.30時判為陰性。

2.6 臨床血清樣本檢測的符合率

用所建立的間接ELISA檢測方法和進口小反芻獸疫標準競爭ELISA試劑盒分別對山羊血清樣品進行檢測。本文建立的間接ELISA方法檢出48份陽性，77份陰性；進口標準競爭ELISA試劑盒檢出50份陽性，80份陰性（表2）。因此，研制的間接ELISA檢測方法的診斷敏感性為96.0%，診斷特異性為96.25%，與進口標準競爭ELISA試劑盒的檢測符合率為96.15%。

表1 兩組人工多肽聯(lián)合包被或單獨包被ELISA比對檢測試驗結果Table 1 ELISA comparison test results of two artificial peptides coated together or separately μg／100μL

表2 自研的間接ELISA方法與進口標準競爭ELISA試劑盒比對試驗結果Table 2 Comparison test results of iELISA homemade and the standard c-ELISA kit imported

（1）診斷特異性：77／80×100%＝96.25%；

（2）診斷敏感性：48／50×100%＝96.0%；

（3）符合率：（48＋77）／130×100%＝96.15%。

3 討論

PPRV屬于副黏病毒科的麻疹病毒屬［1］，與牛瘟病毒（Renderpest virus，RPV）最為接近，且PPR的臨床癥狀和牛瘟相似，所以PPR又稱為小反芻獸假性牛瘟［9］。已有報道指出，基于PPRV全長N蛋白的ELISA檢測方法不能有效區(qū)分PPRV抗體和牛瘟病毒抗體［5，8］，但靠近N蛋白C端的一段大小約為100個氨基酸的區(qū)域不保守，與麻疹病毒屬其他成員之間的同源性僅為17%～30%［8］，且為主要的免疫活性部位，可為特異性檢測PPRV抗體提供最好的抗原［7-8，10，12］。

本文利用的多肽，是分子結構介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，由一種或多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成，既是構成蛋白質(zhì)的結構片段，也是蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的活性基團［17］。通過對蛋白進行二級結構分析，尋找并確定B細胞抗原表位［11，13］，設計盡可能短的多肽，不僅可以提高其免疫活性，減少交叉反應，還能實現(xiàn)多肽的高效合成，發(fā)揮其易于高純度大量制備的最大特點［17］。多肽的這些優(yōu)點克服了通過基因工程表達獲得重組蛋白／多肽時需解決高效表達的技術難題、分離困難、產(chǎn)率低、成本昂貴和難以用于規(guī)模生產(chǎn)等局限性，多肽的應用已成為近年生命科學研究領域的一大熱點［17］。

基于上述研究基礎，本研究截取了PPRV N蛋白靠近 C端的2／3區(qū)段［8，12］，進行了 B細胞抗原表位分析［11-12］，獲取了抗原結合位點的理論位置，設計了多肽序列并經(jīng)化學合成得到多肽，用作包被物成功建立了PPRV血清抗體間接ELISA檢測方法。該方法充分利用了人工合成多肽的生物特性和優(yōu)勢，應用到PPR的預防診斷技術的研發(fā)。人工多肽的設計，優(yōu)勢集中了B細胞抗原表位，提高了包被物與待檢樣品的結合幾率，采用兩段多肽作為聯(lián)合包被物，血清抗體只要與其中一段多肽結合，就能顯示陽性結果，可提高檢測特異性和敏感性。與進口標準競爭ELISA試劑盒進行了比對，驗證了研制的間接ELISA檢測方法的有效性。

PPRV可通過直接接觸進行水平傳播，也可通過精液及胚胎等途徑垂直傳播，還可通過引種、國際貿(mào)易、野生動物遷徙等遠距離跨界傳播［1，6］。據(jù)OIE官網(wǎng)公布，至今我國已有22個省市出現(xiàn)了PPRV的感染病例，由于我國地域遼闊，南來北往人員流動大，動物及動物產(chǎn)品交易頻繁，在缺乏有效的防控和預防診斷措施情況下，PPR在我國傳播蔓延的速度仍然很快［3-4］。本文開創(chuàng)性地利用2段PPRV的N蛋白人工合成多肽，聯(lián)合作為ELISA包被抗原，建立了PPRV血清抗體間接ELISA檢測方法，與進口標準PPRV競爭ELISA試劑盒的檢測符合性達96.15%，充實了我國PPRV診斷檢測技術，也提供了動物疫病ELISA檢測方法建立的新思路。

［1］蔡冬冬，李金海，邢 坤，等.小反芻獸疫概述［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2014（5）：31-33.

［2］郭君衛(wèi).小反芻獸疫疫情的防控［J］.畜牧與飼料科學，2014，35（5）：111-112.

［3］林春斌，涂凌云，吳錄漢，等.我國小反芻獸疫現(xiàn)狀和防控對策［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，2014（3）：47-48.

［4］朱迪國，宗建德，袁麗萍，等.全球小反芻獸疫流行趨勢［J］.中國動物檢疫，2014，31（6）：14-16.

［5］吳 宣，張永寧，關澤英，等.小反芻獸疫診斷技術的研究進展［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2014（6）：30-32.

［6］Padhi A，Ma L.Genetic and epidemiological insights into the emergence of peste des petits ruminants virus（PPRV）across A-sia and Africa［J］.Sci Rep，2014（4）：1-7.

［7］邱文英，李 偉，李 剛，等.小反芻獸疫N蛋白單克隆抗體的制備及競爭ELISA方法的建立［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2011，19（5）：967-972.

［8］邱文英，李 剛，田康樂，等.小反芻獸疫病毒N蛋白主要抗原區(qū)域的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學，2012，2（5）：483-487.

［9］王 凈，李 剛，史利軍.間接ELISA和競爭ELISA檢測小反芻獸疫病毒抗體的比較［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2014，45（2）：333-336.

［10］Muniraju M，Munir M，Parthiban A R，et al.Molecular evolution of peste des petits ruminants virus［J］.Emerg Infect Dis，2014，20（12）：2023-2033.

［11］李 倩，姚淑霞.非洲豬瘟病毒VP73蛋白的B細胞表位預測［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（18）：7680-7682.

［12］Yu R，F(xiàn)an X，Xu W，et al.Fine mapping and conservation analysis of linear B-cell epitopes of peste des petits ruminants virus nucleoprotein［J］.Vet Microbiol，2015，175（1）：132-138.

［13］肖 鏡，付 瑞，賀爭鳴，等.猴B病毒BVgD-多肽ELISA檢測方法的建立［J］.實驗動物科學，2008，25（2）：20-26.

［14］曾少靈，廖立珊，唐金明，等.非洲豬瘟病毒VP73蛋白在昆蟲細胞中的表達與間接ELISA方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（1）：1-6.

［15］楊俊興，曹琛福，曾少靈，等.牛病毒性腹瀉病毒雙單克隆抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應用［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（5）：11-16.

［16］曹琛福，梁云浩，陶 虹，等.非洲豬瘟病毒p54基因的原核表達及其抗體的間接LEISA檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2014，35（2）：6-10.

［17］李永振，賀繼東，彭政，等.多肽的合成與應用進展［J］.化學與生物工程，2010，27（4）：9-14.