2010年-2014年豬流行性腹瀉病毒S 基因遺傳進(jìn)化分析

劉艷成，蘆 婷，劉丹丹，李 靜，張文超，鄧 僑，張 偉，杜雅楠

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬以嘔吐、脫水、腹瀉為主要癥狀的高度接觸性腸道傳染?。?］。各生長(zhǎng)階段的豬群均可發(fā)病，但以未斷乳仔豬最為嚴(yán)重，病死率可高達(dá)100%。該病最早于1976年在比利時(shí)和英國(guó)的部分豬場(chǎng)被發(fā)現(xiàn)，此后，荷蘭、德國(guó)、法國(guó)、匈牙利、前蘇聯(lián)、日本、韓國(guó)、越南、緬甸、中國(guó)臺(tái)灣等國(guó)家和地區(qū)也陸續(xù)發(fā)生本病的流行［2］。我國(guó)內(nèi)地自20世紀(jì)80年代初開始陸續(xù)有本病發(fā)生的報(bào)道。2010年以來，隨著新毒株的出現(xiàn)，該病在我國(guó)的流行情況更趨嚴(yán)重［3］。美國(guó)自2013年5月PED首次暴發(fā)以來，已迅速蔓延至30多個(gè)州，波及4 000多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，累計(jì)死亡仔豬超過700萬頭。日本、加拿大、墨西哥、哥倫比亞等國(guó)也相繼暴發(fā)此病，歐洲多國(guó)也開始研究防止PEDV傳入的策略［4-5］。

PEDV是尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒亞科（Coronavirinae）的一員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒［6］。其S基因編碼病毒纖突蛋白（S蛋白），根據(jù)其他冠狀病毒的S蛋白可以將PEDV的S蛋白劃分為S1（1-735aa）和S2（736-1 383aa）兩個(gè)結(jié)構(gòu)域［7-8］。S蛋白在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用［9］。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，S基因存在較高變異性，不同分離株S基因之間存在不同程度的核苷酸插入、突變和刪減等現(xiàn)象，進(jìn)而改變病毒原始抗原特性，因此常被用來研究不同時(shí)間和不同地區(qū)流行毒株的親緣關(guān)系［10］。

本研究通過DNA Star、MEGA6等軟件對(duì)2010年-2014年NCBI上已收錄的319株P(guān)EDV的S基因進(jìn)行多序列比對(duì)，篩選出6個(gè)國(guó)家和地區(qū)的代表性流行毒株，并對(duì)各代表毒株、疫苗株、經(jīng)典毒株進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。旨在通過對(duì)不同流行毒株的序列進(jìn)化分析，明確PEDV S基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為該病的分子流行病學(xué)研究及疫苗株的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因序列來源 2010年-2014年NCBI上已登錄的319株P(guān)EDV S基因序列，其中中國(guó)流行毒株181株、美國(guó)流行毒株98株、韓國(guó)流行毒株25株、加拿大流行毒株6株、日本流行毒株6株、越南流行毒株3株。

1.1.2 疫苗株及經(jīng)典毒株 疫苗株包括中國(guó)的CV777細(xì)胞株、CH／S滬毒株，韓國(guó)的 DR13、KPEDV-9弱毒株，日本的83P-5細(xì)胞株。

經(jīng)典毒株包括歐洲 CV777、Br1／87，韓國(guó)的SM98、Chinju99，中國(guó)北方毒株 LJB／03、南方毒株JS-2004-2和JS-HZ2012、西部毒株DX和LZC（表1）。

表1 疫苗株和經(jīng)典毒株的基本信息Table 1 The information of vaccine strains and classical strains from different countries

1.2 方法

1.2.1 代表毒株的篩選 利用MEGA6的Clustal W功能對(duì)各國(guó)流行毒株進(jìn)行多序列比對(duì)，并應(yīng)用Neighbor-Joining Tree方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)遺傳距離差異性篩選出各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的代表性流行毒株。

1.2.2 代表毒株、疫苗株、經(jīng)典毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系 根據(jù)1.2.1所確定的各國(guó)代表性流行毒株，與臨床上常用的疫苗株及經(jīng)典毒株進(jìn)行多序列比對(duì)，并應(yīng)用Neighbor-Joining Tree法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)遺傳進(jìn)化結(jié)果分析2010年-2014年各國(guó)PEDV S基因與疫苗株及經(jīng)典毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.2.3 S基因的序列分析 利用DNA Star中的MegAlign功能對(duì)代表毒株、疫苗株、經(jīng)典毒株的S基因進(jìn)行序列分析，了解各國(guó)代表性流行毒株與經(jīng)典毒株及疫苗株相比是否存在核苷酸和氨基酸的突變、插入和缺失位點(diǎn)，并明確主要高變區(qū)域的結(jié)構(gòu)位置。

2 結(jié)果

2.1 代表性流行毒株的篩選

根據(jù)不同國(guó)家PEDV S基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果，篩選出各國(guó)具有代表性的流行毒株。其中中國(guó)的181株流行毒株中篩選出42株作為代表毒株，美國(guó)的98株流行毒株中篩選出18株作為代表毒株，韓國(guó)的25株流行毒株中篩選出8株作為代表毒株，加拿大6株流行毒株中篩選出4株作為代表毒株，日本6株流行毒株中篩選出4株作為代表毒株；越南的3株流行毒株中篩選出2株作為代表性毒株，總計(jì)78株，各代表毒株的基本信息見表2。

2.2 代表毒株、疫苗株、經(jīng)典毒株的遺傳進(jìn)化分析

利用所篩選的78株代表毒株、6株疫苗株、9株經(jīng)典毒株的S基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖1）。進(jìn)化樹可分為G1、G2兩大分支，其中G1可分為G1-1、G1-2兩小分支，G2也可分為G2-1、G2-2兩小分支。福建株CH／FJND-2／2012為G2-1分支上的唯一成員；美國(guó)的3株流行株 （USA／Indiana12.83／2013、USA／Ohio126／2014、USA／Iowa23.57／2013），中國(guó)的8株流行株 （CH／FJXM-2、CH13／GX、CH／JLGZL、CH-AHHF、CH／BJSY 、CH／JL 、AH-M 、SD-M／2012），加拿大的 SK／030 株，日本的 MK、83P-5 100th流行株，經(jīng)典毒株JS-2004-2、LJB／03、DX、CV777、LZC、SM98、Br1／87，疫苗株Vaccine CV777、CH／S、KPEDV-9、DR13、DR13、83P-5同位于G2-2分支上。經(jīng)典毒株Chinju99和JS／HZ／2012與剩余的63條代表毒株同位于G1上，其中韓國(guó)經(jīng)典毒株Chinju99與韓國(guó)的NJ02／2012、AS01／2012、AD0／2012流行毒株，日本的NK、KH野豬毒株同位于G1-2分支上。而較新的經(jīng)典毒株JSHZ2012與其余的流行毒株同位于G1-1分支上。

2.3 S基因的序列分析

部分毒株氨基酸比對(duì)結(jié)果表明，S蛋白共存在218處氨基酸位點(diǎn)的突變，其中S1區(qū)（1-735aa）存在142個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，占突變位點(diǎn)總數(shù)的65.60%（143／218），僅S1區(qū)的 N′端（1-370aa）就存在86處氨基酸突變位點(diǎn)，占S1區(qū)突變位點(diǎn)的60.14%（86／143）。此外，S1區(qū)的58-62、140、159-160aa位均存在氨基酸的插入和缺失現(xiàn)象（圖2）。綜上所述，S蛋白氨基酸位點(diǎn)的突變、插入和缺失現(xiàn)象主要發(fā)生于S1區(qū)，特別是其N′端。

表2 代表毒株的篩選結(jié)果Table 2 The screening results of representative strains

3 討論

大量試驗(yàn)研究表明，PEDV在流行的過程中為更好地適應(yīng)環(huán)境，不同地區(qū)PEDV流行毒株的S蛋白會(huì)發(fā)生不同程度的變異，因此，有必要進(jìn)一步對(duì)PEDV流行毒株的遺傳背景進(jìn)行調(diào)查，了解不同國(guó)家和地區(qū)PEDV S基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系。本試驗(yàn)通過對(duì)2010年-2014年多個(gè)國(guó)家PEDV流行毒株的S基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化與序列分析，明確近年來PEDV的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為病原診斷和現(xiàn)地疫苗候選株篩選提供依據(jù)。

遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，78株代表性流行毒株中僅有15株流行毒株與疫苗株及經(jīng)典毒株同位于G2分支上，且沒有明顯的國(guó)籍及時(shí)間特征，表明近幾年大多數(shù)流行毒株與疫苗株及經(jīng)典毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中流行毒株SD-M／2012、CH／JL／2011、AH-M／2014與中國(guó)現(xiàn)用疫苗株CV777親緣關(guān)系最近，位于同一小分支上，筆者推測(cè)這3株流行毒株可能為現(xiàn)用疫苗株CV777的變異株。而部分美國(guó)毒株（USA／Indiana12.83／2013、USA／Ohio126／2014、USA／Iowa23.57／2013），中 國(guó) 的 CH／FJXM-2、CH13／GX、CH／JLGZL、CH-AHHF、CH／BJSY 流行毒株和加拿大的SK／030毒株則與JS-2004-2、DX、LJB-03這3個(gè)中國(guó)經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較近，推測(cè)其可能由這3個(gè)經(jīng)典毒株演變而來。剩余的58株代表性流行毒株與JS-HZ／2012株親緣關(guān)系較近，同位于G1-1分支上，沒有明顯的國(guó)籍及時(shí)間特征。但整體觀察可知，2010年-2014年的流行毒株與較早的疫苗株及經(jīng)典毒株遺傳距離差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但與近幾年的經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較近，說明盡管各毒株間沒有時(shí)間上的明顯規(guī)律，但其變異過程仍需一定時(shí)間的積累。

通過對(duì)PEDV S基因的核苷酸、氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)S基因變異性較大，且集中發(fā)生在N′末端區(qū)域，這一結(jié)果與 Lee D K 等［11］對(duì)7株韓國(guó)PEDV毒株的S基因進(jìn)行序列分析的結(jié)果一致。鄭逢梅等［10］通過對(duì)12株P(guān)EDV流行毒株S、M 和ORF3基因部分核苷酸及氨基酸的序列分析，發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵序列明顯不同于以往毒株，其中有11株流行毒株的S基因比現(xiàn)用疫苗株CV777多9個(gè)核苷酸，且在其S1區(qū)N′端存在大量的氨基酸突變。Chen J等［3］通過對(duì)除西藏和青海外中國(guó)的29個(gè)?。ㄊ小^(qū)）577份腹瀉樣品進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查分析，證實(shí)33個(gè)分離株在S基因N′末端1-370aa存在不同程度堿基的刪減或插入現(xiàn)象。

圖1 流行毒株、經(jīng)典毒株、疫苗株的遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analyses of prevailing strains，classic strains，vaccine strains

圖2 部分PEDV S蛋白氨基酸比對(duì)結(jié)果Fig.2 Amino acid sequence alignment of the S protein of part PEDV strains

PED是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一，雖未被列入國(guó)家農(nóng)業(yè)部重大動(dòng)物疫病名錄，但卻嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。自1995年豬傳染性胃腸炎（華毒株）與PED（CV777疫苗株）二聯(lián)弱毒苗及滅活苗在我國(guó)投入使用以來，顯著降低了該病對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成的損失。但自2006年起，PED開始在免疫豬群中流行［12］，特別是從2010年10月開始，中國(guó)南部10多個(gè)省份暴發(fā)大規(guī)模的PED，導(dǎo)致超過100萬頭仔豬的死亡。此后，該病迅速蔓延至全國(guó)各個(gè)省份，由此造成的發(fā)病和死亡率至今仍然無法得到有效的控制［13］。根據(jù)各地報(bào)道可以看出用于試驗(yàn)研究的豬群大多使用了PED滅活苗或弱毒苗（CV777株），但發(fā)病率和未斷乳仔豬的病死率依然很高，由此說明疫苗免疫或母源抗體并不足于保證豬只免受PEDV的侵襲。原因可能有兩個(gè)：①流行毒株發(fā)生變異，從而導(dǎo)致免疫失敗；②流行毒株毒力增強(qiáng)，導(dǎo)致疫苗或其他途徑產(chǎn)生的免疫力并不足以保護(hù)豬只免于感染而發(fā)病。由于RNA聚合酶缺乏矯正功能，所以RNA病毒容易發(fā)生變異。PEDV滅活苗及弱毒疫苗的使用一度使該病的感染顯著減少，但可能正是由于疫苗的長(zhǎng)期使用從而使得PEDV在免疫壓力下發(fā)生變異，導(dǎo)致出現(xiàn)免疫逃逸。本試驗(yàn)通過對(duì)各代表毒株、疫苗株、經(jīng)典毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系及序列變化進(jìn)行分析，證實(shí)目前全球范圍內(nèi)廣泛流行的PED的流行毒株與經(jīng)典毒株及疫苗株的基因序列發(fā)生了很大程度的變異。因此，盡快從當(dāng)前流行毒株中篩選出新的疫苗候選株將成為防控該病繼續(xù)蔓延的關(guān)鍵措施之一。

［1］尹寶英，吳旭錦，熊忙利.豬流行性腹瀉診斷方法研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（12）：156-159.

［2］Song D，Park B.Porcine epidemic diarrhea virus：a comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines［J］.Virus Genes，2012，44：167-175.

［3］Chen J F，Sun D B，Wang C B，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of membrane protein genes of porcine epidemic diarrhea virus isolates in China［J］.Virus Genes，2008，36：355-364.

［4］Jung K，Wang Q H，Scheuer K A，et al.Pathology of US porcine epidemic diarrhea virus Sstrain PC21Ain gnotobiotic pigs［J］.Emerg Infec Dis，2014，20（4）：662-665.

［5］Wang L Y，Beverly B，Zhang Y.New variant of porcine epidemic diarrhea virus，United States［J］.Emerg Infec Dis，2014，20（5）：917-919.

［6］Pensaert M B，de Bouck P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine［J］.Arch Virol，1978，58：243-247.

［7］Jackwood M W，Hilt D A，Callison S A，et al.Spick glycoprotein cleavage recognition site analysis of infectious bronchitis virus［J］.Avian Dis，2001，45（2）：366-372.

［8］陳弟詩，任玉鵬，張 斌，等.豬流行性腹瀉病毒S基因研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（7）：77-81.

［9］Kang T，Seo J，Kim D，et al.Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants［J］.Protein Expres Purif，2005，41（2）：378-383.

［10］鄭逢梅，霍金耀，趙 軍，等.2010年～2012年華中地區(qū)豬流行性腹瀉病毒分子特征和遺傳進(jìn)化分析［J］.病毒學(xué)報(bào)，2013，29（2）：197-205.

［11］Lee D K，Park C K，Kim S H，et al.Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea［J］.Virus Res，2010，149（2）：175-182.

［12］Chen J，Wang C，Shi H，et al.Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China［J］.Arch Virol，2010，155（9）：1471-1476.

［13］Sun R Q，Cai R J，Chen Y Q，et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China［J］.Emerg Infec Dis，2012，18（1）：161-163.