牛源腸出血性大腸埃希菌的分離鑒定及進(jìn)化分析

郭 銳，譚 臣，彭 忠，華 琳，曾東柱，吳 斌＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；3.咸寧市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北咸寧 437000）

腸出血性大腸埃希菌（EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC）是一群重要的能夠引起人類致病的食源性病原菌，主要寄生在反芻動(dòng)物腸道內(nèi)，是一種人獸共患傳染病的病原［1］，可以引起人的血樣腹瀉、出血性結(jié)腸炎（Haemorrhagic colitis，HC）和溶血性尿毒綜合征（Haemolytic uraemic syndrome，HUS）。溶血性尿毒綜合征主要表現(xiàn)為腎臟衰竭、溶血性貧血及血小板減少等［2］。EHEC主要產(chǎn)生2種志賀毒素，包括1型志賀毒素（Shiga toxin，由stx1基因編碼）和2型志賀毒素（Shiga toxin，由stx2基因編碼）。志賀毒素又稱Vero細(xì)胞毒素，對(duì)Vero細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性［3］。有些EHEC還攜帶其他毒力基因，一是黏附素基因，它可以表達(dá)一種黏附素，主要對(duì)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附與損傷［4］；二是溶血素基因，編碼分泌型溶血素蛋白，溶血素蛋白能在含有紅細(xì)胞的血瓊脂平板產(chǎn)生溶血圈［5］。

雖然在全球范圍內(nèi)大面積暴發(fā)或散發(fā)HUS病例主要由EHEC O157：H7引起，但目前已發(fā)現(xiàn)有200多種非O157EHEC能夠引起人發(fā)?。?］。2002年-2005年對(duì)全世界35個(gè)國(guó)家腹瀉病例監(jiān)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由非O157EHEC感染的比率增加了60.5%，而由O157EHEC感染比率增加了13%。特別是在2011年5月，德國(guó)暴發(fā)了一起由EHEC O104：H4感染引起的疫情，據(jù) WHO 2011年7月22日數(shù)據(jù)顯示，此次疫情共導(dǎo)致4 075人發(fā)病，其中50人死亡［7］。這也預(yù)示了未來(lái)非O157EHEC的流行與暴發(fā)將會(huì)威脅人類公共衛(wèi)生安全，成為人類公共衛(wèi)生領(lǐng)域一個(gè)很重要的問(wèn)題。

1999年，我國(guó)江蘇、安徽兩省暴發(fā)流行EHEC O157：H7感染性腹瀉，患者超過(guò)2萬(wàn)人，其中177人死亡。2000年，我國(guó)衛(wèi)生部出臺(tái)了關(guān)于EHEC O157：H7監(jiān)測(cè)方案，加強(qiáng)了對(duì)中國(guó)部分地區(qū)EHEC O157：H7的監(jiān)測(cè)。但是我國(guó)對(duì)于非O157EHEC病原菌分離鑒定及流行病學(xué)調(diào)查尚未系統(tǒng)的展開(kāi)［8］。本研究主要對(duì)2012年-2013年湖北省部分奶牛場(chǎng)的奶牛、牛奶及環(huán)境中的水樣進(jìn)行EHEC分離，并進(jìn)行鑒定。對(duì)分離菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，利用MLST分型技術(shù)對(duì)分離菌株進(jìn)行分子分型及其遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，了解其進(jìn)化歷史并比較與國(guó)際上EHEC流行菌株的親緣關(guān)系，加強(qiáng)我國(guó)對(duì)這一類菌株的監(jiān)測(cè)與檢測(cè)，為該病的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及細(xì)胞 EHEC O157：H7標(biāo)準(zhǔn)菌株（EDL933）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)栗紹文老師惠贈(zèng)；大腸埃希菌DH5α為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)際重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶及主要試劑 rTaqDNA 聚合酶、dNTPs、10×PCR 緩沖液、DNA Marker DL 2 000為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒 （Bacteria Gene DNA kit）為TIANGEN試劑公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、蛋白酶K為Invitrogen公司產(chǎn)品；亞碲酸鉀（potassium tellurete）、頭孢克肟（cefixime）為青島日水生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；全套大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)抗O抗原單因子血清為中國(guó)獸藥監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.3 主要培養(yǎng)基及其配制 胰酶大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、胰酶大豆肉湯 （tryptic soy broth，TSB）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；改良山梨醇麥康凱瓊脂為青島日水生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，并置于4℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 2013年1月～5月于湖北武漢、黃岡、宜昌3個(gè)奶牛場(chǎng)共采集新鮮直腸糞便397份，新鮮牛奶99份及環(huán)境中水樣69份，將采集到的新鮮糞便、牛奶、水樣分別放入含有TSB的2mL滅菌離心管中，并在相應(yīng)的離心管上標(biāo)記牛的耳號(hào)，置于含有冰塊的保溫盒內(nèi)并立即送回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2.2 樣本的前增菌 每次將上述采集回的樣品先進(jìn)行渦旋混勻，500r／min離心1min，吸取上層液體500μL置于含有5mL加有新生霉素（20μg／mL）的TSB中，放入42℃水浴鍋中靜置培養(yǎng)18h～24h。

1.2.3 初篩與分離 取增菌后的樣本2mL，用煮沸法制備菌體模板，stx1基因引物序列參照文獻(xiàn)［9］報(bào)道的序列，stx2基因引物序列參照文獻(xiàn)［10］報(bào)道的序列，引物序列及目的片段大小如表1所示，擴(kuò)增相關(guān)毒力基因的PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94 ℃ 30s，stx1基因（60 ℃退火）、stx2基因（64 ℃退火）40s，72 ℃、1min，30個(gè) 循 環(huán)；最 后72 ℃10min。同時(shí)設(shè)參考菌株陽(yáng)性、無(wú)模板陰性做對(duì)照。取5μL PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取stx1和／或stx2基因檢測(cè)為陽(yáng)性樣品的增菌液100μL，分別劃線接種于CT-SMAC上，37℃恒溫培養(yǎng)18h～24h，進(jìn)行細(xì)菌分離，經(jīng)純培養(yǎng)后再進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

表1 PCR檢測(cè)引物Table 1 Primers for PCR assay

1.2.4 分離菌血清型鑒定 將分離株劃線接種于TSA平板上，37℃恒溫培養(yǎng)18h～24h，然后用3mL 5mL／L石炭酸生理鹽水洗下，制成懸液，以121℃高壓滅菌鍋處理2h，冷卻后分別與大腸埃希菌單因子診斷血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，通過(guò)觀察是否有凝集顆粒來(lái)確定分離菌株所屬大腸埃希菌血清型。同時(shí)設(shè)生理鹽水陰性對(duì)照，觀察有無(wú)自凝現(xiàn)象。

1.2.5 相關(guān)毒力基因的檢測(cè) 將經(jīng)鑒定純化后的分離菌株于TSB中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后按照TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取分離菌株的基因組，置-20℃保存?zhèn)溆?。以提取的分離菌株基因組為模板，PCR檢測(cè)EHEC其他4個(gè)相關(guān)毒力基因，即eae、ehxA、saa、wzxO157。eae基因引物序列參照文獻(xiàn)［11］報(bào)道的序列，ehxA基因引物序列參照文獻(xiàn)［12］報(bào)道的序列，saa基因和wzxO157基因引物序列參照文獻(xiàn)［13］報(bào)道的序列（表1）。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5min；94℃30s，退火（eae基因?yàn)?4℃，ehxA、saa、wzxO157基因?yàn)?0℃）40s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。同時(shí)設(shè)參考菌株陽(yáng)性、無(wú)模板陰性作為對(duì)照。

1.2.6 EHEC對(duì)Vero細(xì)胞毒性檢測(cè) 挑取分離菌株于含有5mL TSB細(xì)菌瓶中，于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18h～24h。然后離心吸取上清液通過(guò)0.22mm孔徑的微孔過(guò)濾。過(guò)濾后的液體即為志賀毒素，然后測(cè)定其Vero細(xì)胞毒性。同時(shí)設(shè)EHEC O157：H7（EDL933）標(biāo)準(zhǔn)菌株陽(yáng)性對(duì)照，大腸埃希菌DH5α及細(xì)胞培養(yǎng)液陰性對(duì)照［14］。

1.2.7 腸出血性大腸埃希菌遺傳進(jìn)化分析

1.2.7.1 MLST分型 參照E.coliMLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／mlst.ucc.ie／mlst／mlst／dbs／E.coli）大 腸埃希菌MLST分型方案，選擇7個(gè)管家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA 和recA。PCR引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小如表2所示，PCR擴(kuò)增條件為：95℃5min；94℃30s，退火（溫度根據(jù)不同管家基因設(shè)置）45s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。每次擴(kuò)增均以無(wú)DNA模板的體系作為空白對(duì)照。取PCR產(chǎn)物3μL用12g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用相應(yīng)測(cè)序引物（表2）送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表2 7個(gè)管家基因及測(cè)序的PCR引物Table 2 PCR primers for seven housekeeping genes

1.2.7.2 遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 使用DNA Star軟件結(jié)合分離菌等位基因正反向序列圖譜對(duì)等位基因序列進(jìn)行拼接與校正。然后將校正后的序列輸入到E.coliMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，從而確定分離菌株的等位基因型和序列型（sequence type，ST）。用MEGA 5.0軟件分析不同分離株之間遺傳進(jìn)化關(guān)系及與國(guó)際上流行EHEC的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 EHEC初步分離結(jié)果

從2013年1月～5月采集的565份樣本中，PCR檢測(cè)stx1／stx2基因陽(yáng)性樣本數(shù)為60份，檢出率為10.6%，通過(guò)CT-SMAC平板獲得EHEC分離株共40株，分離率為7.1% （40／565）。部分EHEC分離菌株詳細(xì)信息見(jiàn)表3和表4。

表3 牛源腸出血性大腸埃希菌分離結(jié)果Table 3 The isolation results of EHEC from cows

表4 40株牛源腸出血性大腸埃希菌血清型、毒力因子及MLST分型結(jié)果Table 4 Serotypes，virulence factors and MLST typing results of the 40EHEC strains

2.2 血清型鑒定結(jié)果

通過(guò)玻片凝集試驗(yàn)對(duì)40株EHEC進(jìn)行血清型的鑒定，共鑒定出17種血清型，此外有2株發(fā)生自凝（表4），其中 O157、O26、O91、O100、O97、O92為主要血清型，O157、O26、O145、O91為典型血清型，與之對(duì)應(yīng)的分離菌株數(shù)分別是4株、4株、1株、7株，分別占已定型菌株的10%、10%、2.5%和17.5%。40株牛源EHEC不同血清型所占比例如表5所示。

表5 40株牛源腸出血性大腸埃希菌血清型鑒定結(jié)果Table 5 Serotypes of 40EHEC strains from dairy cows

2.3 EHEC相關(guān)毒力基因檢測(cè)結(jié)果

stx1／stx2基因陽(yáng)性菌株經(jīng)鑒定純化后，用PCR檢測(cè)其他4個(gè)毒力基因，即eae、ehxA、saa和wzxO157。結(jié)果表明，攜帶stx1基因EHEC分離率為82.5% （33／40），攜帶stx2基因EHEC分離率為75% （30／40），遠(yuǎn)高于eae、ehxA、saa、wzxO157檢出率。40株EHEC 6個(gè)主要毒力基因檢測(cè)結(jié)果如表6所示。40株EHEC多毒力基因同時(shí)攜帶檢出率見(jiàn)表7，其中同時(shí)攜帶stx1、stx2、ehxA 3個(gè)毒力基因EHEC有18株，占分離菌株比例為45%，分離率最高，其次是同時(shí)攜帶stx1、stx2、ehxA、saa 4個(gè)毒力基因菌株有7株，占分離菌株比例為17.5%。其中有2株 EHEC O157stx1、stx2、eae、ehxA、saa基因檢測(cè)都是陰性，而wzxO157基因是陽(yáng)性。

表6 40株牛源腸出血性大腸埃希菌主要毒力基因檢出率Table 6 The detection rate of 40EHEC virulence genes from cow

表7 93株不同來(lái)源腸出血性大腸埃希菌同時(shí)攜帶多個(gè)毒力基因檢出率Table 7 The detection rate of 93different sources of EHEC strains carrying different virulence genes together

2.4 EHEC對(duì)Vero細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

EHEC主要毒力因子是志賀毒素，志賀毒素又稱為Vero細(xì)胞毒素，通過(guò)檢測(cè)EHEC對(duì)Vero細(xì)胞毒性來(lái)證明EHEC是否產(chǎn)生志賀毒素。結(jié)果表明，凡是通過(guò)PCR檢測(cè)攜帶有stx1／stx2基因陽(yáng)性菌株，其產(chǎn)生的毒素都能使Vero細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，而stx1／stx2基因陰性菌株不能使Vero細(xì)胞產(chǎn)生病變。

2.5 腸出血性大腸埃希菌MLST分型結(jié)果

40株EHEC在E.coliMLST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)結(jié)果表明，包括13個(gè)ST型，其中ST297序列型分離率最高，分離數(shù)為29株，占分離菌株比例為31.1%，不同序列型菌株占分離菌株比例見(jiàn)表8，其中4株典型的EHEC O157都屬于ST542型，2株EHEC O26都屬ST297型。

表8 93株不同來(lái)源腸出血性大腸埃希菌不同序列型占分離菌株的比例Table 8 The rate of different ST type from 93different sources of EHEC strains

2.6 腸出血性大腸埃希菌遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA 5.0軟件從堿基組成角度來(lái)對(duì)93株EHEC的13個(gè)ST型及與國(guó)際上流行的EHEC優(yōu)勢(shì)血清型 （O157：H7、O103：H11、O26：H11、O111：H8、O104：H4、O45：H2、O121：H19、O145：H＋）的6個(gè)ST型做了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，按順序?qū)⒚總€(gè)ST型的7個(gè)管家基因的序列進(jìn)行拼接，然后采用Neighbor-joining法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值的計(jì)算分析根據(jù)1 000次隨機(jī)抽樣進(jìn)行，結(jié)果如圖1。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明分離率最高的ST297型與ST678（O104：H4），ST17（O45：H2）親緣關(guān)系最近，這說(shuō)明此次分離的菌株大多數(shù)與國(guó)際流行的EHEC血清型O104：H4，O45：H2親緣關(guān)系較近。其次是ST29型與ST16（O111：H8）、ST21（O26：H11，O145：H＋）、ST723（O103：H11）、ST1623處于一個(gè)大的分支。

3 討論

EHEC是產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌中的一類亞群，可以引起人的血樣腹瀉、出血性結(jié)腸炎及 HUS等。O157：H7是EHEC代表血清型，國(guó)內(nèi)對(duì)EHEC O157：H7流行情況研究的很多，而目前已發(fā)現(xiàn)有200多種非O157：H7血清型的EHEC也能夠?qū)θ酥虏。渲饕逍蜑?O26、O111、O104、O91、O145、O103、O121、O45［15］。本研究對(duì)2013年湖北省部分奶牛場(chǎng)牛群進(jìn)行EHEC的分離與鑒定，共分離到40株EHEC，但并未在牛奶及養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中的水樣中分離到EHEC。因?yàn)镋HEC主要毒力因子是志賀毒素，所以通過(guò)PCR方法來(lái)檢測(cè)樣本中的stx1／stx2基因，然后結(jié)合CT-SMAC平板法進(jìn)行分離，通過(guò)PCR結(jié)合CT-SMAC平板分離法大大提高了EHEC的分離率。通過(guò)對(duì)分離的40株EHEC進(jìn)行血清型鑒定表明，共涵蓋了17種血清型，典型EHEC血清型 O157 4株、O26 4株、O91 7 株和O145 1株，在歐洲由血清型 O26：H11及O91：H21的EHEC引起的HUS病例常有報(bào)道。

圖1 40株牛源腸出血性大腸埃希菌不同ST型的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of different ST type 40EHEC from cow

40株EHEC毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，stx1基因陽(yáng)性菌株為33株，占分離菌株比例為82.5%；stx2基因陽(yáng)性菌株為30株，占分離菌株比例為75%；ehxA基因陽(yáng)性菌株為36株，占分離菌株比例為90%；同時(shí)攜帶stx1、stx2兩種基因有25株，占分離菌株比例為62.5%，說(shuō)明此次分離的EHEC更多的同時(shí)攜帶stx1、stx2兩種毒力基因。EHEC同時(shí)攜帶stx1、stx2兩種毒力基因和只攜帶stx2基因致病力的強(qiáng)弱尚不清楚，有報(bào)道稱僅攜帶stx2基因的EHEC毒力要高于同時(shí)攜帶stx1、stx2兩個(gè)毒力基因的EHEC。此次分離的EHEC O157，其中有2株沒(méi)有檢測(cè)到stx1、stx2、ehxA、eae、saa幾種毒力基因，但是其致病力的強(qiáng)弱還有待進(jìn)一步的研究。志賀毒素又稱Vero細(xì)胞毒素，通過(guò)檢測(cè)EHEC對(duì)Vero細(xì)胞毒性來(lái)證明EHEC是否產(chǎn)生志賀毒素。結(jié)果表明，凡是通過(guò)PCR檢測(cè)攜帶有stx1／stx2基因的EHEC其產(chǎn)生的毒素都能使Vero細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，而stx1／stx2基因陰性菌株不能使Vero細(xì)胞產(chǎn)生病變，說(shuō)明EHEC能夠分泌志賀毒素，而志賀毒素在EHEC致病過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

利用MLST分型技術(shù)對(duì)EHEC進(jìn)行分子分型及其遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，了解其進(jìn)化特征，對(duì)追蹤暴發(fā)溯源具有重要意義。本研究對(duì)40株EHEC進(jìn)行MLST分型，共7個(gè)ST型，其中ST297序列型分離率最高，共分離出23株，占分離菌株比例為57.5%。其中典型的4株EHEC O157都屬于ST542型，2株EHEC O26都屬于ST297型。利用 MEGA 5.0軟件對(duì)40株EHEC進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析表明，分離率最高的ST297型與 ST678（O104：H4）、ST17（O45：H2）親緣關(guān)系最近，這說(shuō)明此次分離的菌株大多數(shù)與國(guó)際流行的EHEC血清型O104：H4、O45：H2親緣關(guān)系較近。其次是ST29型與ST16（O111：H8）、ST21（O26：H11，O145：H＋）、ST723（O103：H11）和ST1623處于一個(gè)大的分支。

EHEC的研究涉及的學(xué)科包括食品微生物學(xué)、動(dòng)物醫(yī)學(xué)、人類醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)及食品衛(wèi)生學(xué)。目前對(duì)于EHEC的治療沒(méi)有有效的方法，對(duì)EHEC診斷、監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)的調(diào)查及其致病機(jī)理的研究非常重要。因此，對(duì)于EHEC的防控最好的方法是預(yù)防宿主的感染，加強(qiáng)食品衛(wèi)生的監(jiān)測(cè)與檢測(cè)。

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