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    互花米草NHX1基因的cDNA全長克隆、序列信息及定量表達分析

    2017-02-15 18:50:54徐璐??尹海波??張俠??曹雪霖?
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2016年8期
    關鍵詞:液泡互花耐鹽

    徐璐??+尹海波??+張俠??+曹雪霖??+盧楠楠??+閆麗華??陳世華??郭善利

    摘要:以鹽生植物互花米草(Spartina alterniflora)為試驗材料,利用RACE技術克隆到編碼Na+/H+逆向轉運蛋白的[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因的cDNA全長序列。利用生物信息學軟件及網(wǎng)站對獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質序列進行分析,結果發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列長度為2 277 bp,開放閱讀框為1 623 bp,編碼540個氨基酸殘基,且該基因所編碼的蛋白質與植物的Na+/H+逆向轉運蛋白NHX1 同源,所以命名為[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因。同時氨基酸序列比對顯示,其與蘆葦(Phragmites australis NHX,BAD95562.1)、玉米(Zea mays NHX,XP_008653443.1)、水稻(Oryza sativa NHX,BAA83337.1)等的NHX親緣關系相近,同源相似性依次為94%、92%、91%。利用Qiagene Rotor Gene Q熒光實時定量PCR儀對不同時間鹽處理及ABA處理的互花米草材料進行熒光定量PCR檢測。結果發(fā)現(xiàn),在鹽處理及ABA處理的不同處理時期,該基因的相對表達量都發(fā)生了明顯的變化,這表明該基因受到了鹽脅迫及ABA脅迫的誘導,由此可以看出[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因與植物的耐鹽性有著密切的關系。

    關鍵詞:耐鹽性;互花米草;[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因;相對定量表達

    中圖分類號: Q785;Q786文獻標志碼:

    隨著土壤鹽堿化面積的不斷增加,植物面臨著越來越嚴峻的高鹽挑戰(zhàn)。土壤中高濃度的鹽分會給植物帶來生理干旱、離子毒害等多種危害,嚴重影響到植物的正常生長發(fā)育,從而抑制農(nóng)作物的高產(chǎn)。對于大部分植物來說,高鹽脅迫對植物的危害主要是由高濃度的Na+積累所導致的。雖然不同植物的耐鹽機制存在差異,但是其基本策略都是保持胞內Na+的平衡[1]。其中,植物體內的液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白(vacuolar Na+/H+antiporter)在植物抗鹽堿的過程中起著至關重要的作用,它可以將細胞質中過多的Na)隸屬禾本科米草屬,是典型高度耐鹽的泌鹽鹽生植物。它起源于美洲大西洋沿岸和墨西哥灣,適宜生活于潮間帶,同時具有很好的耐淹、抗風浪能力。它體內也存在著一類Na+/H+逆向轉運蛋白,以此來減輕Na+毒害。因此,互花米草材料對于研究植物耐鹽機制是一個很好的選擇,但是目前我國關于互花米草作為耐鹽基因資源方面的研究并不多見。為了進一步了解互花米草抗鹽性的分子機制,本研究以互花米草為材料,克隆得到了互花米草Na+/H+逆向轉運蛋白基因[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ],利用生物信息學軟件及網(wǎng)站對獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質序列進行分析,利用Qiagene Rotor Gene Q熒光實時定量PCR儀對互花米草在NaCl及ABA不同處理時間條件下表達量的變化情況進行檢測,為的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1試驗材料

    互花米草種子來源于山東萊州海濱,放置于4 ℃保存。取出保存的種子播種于耶土 ∶[KG-*3]黑土=1 ∶[KG-*3]1 的培養(yǎng)基質中,于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h的溫室條件下進行培養(yǎng),2周后選取長勢一致的植株移栽到小方盆中繼續(xù)培養(yǎng)至4~5葉齡。用于基因克隆的取材:用 600 mmol/L NaCL溶液澆灌幼苗 48 h;用于定量表達分析的取材:分別用600 mmol/L NaCl溶液和 100 μmol/L ABA溶液對幼苗進行澆灌和噴灑,處理時間為0(對照)、3、6、12、24、48 h,每個處理重復3次。所有取材均經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存。

    大腸桿菌DH5α為實驗室保存;pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、dNTP Mix、DNA限制性內切酶均購自TaKaRa公司;BIOZOL RNA Kit購于BIOFLUX公司;Reverse Transcriptase試劑盒購于Promega公司;Kanamycin Sulfate購于Sigma公司;試驗中所用其他試劑大多為國產(chǎn)分析純,部分試劑是參照文獻[13]自行配制的,所有引物的合成均由北京華大六合基因公司合成。

    1.2試驗方法

    反應條件為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性 10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸20 s;40個循環(huán)),并分析試驗結果。

    1.3數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)采用Origin 8.0進行處理,利用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,差異顯著性水平α=0.05。

    2結果與分析

    2.1互花米草的克隆及序列分析

    根據(jù)實驗室互花米草轉錄組測序結果及Blast比對分析設計特異引物,分別進行5′RACE及3′RACE(圖1),根據(jù)測序結果進行比對拼接獲得[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因全長序列信息(圖2)。

    基因全長序列為2 277 bp,開放閱讀框(ORF)為1 623 bp,編碼540個氨基酸殘基(圖2)。ExPASy 在線程序預測其編碼的蛋白質分子質量為 59.4 ku,等電點為8.89。經(jīng)TMHMM在線程序分析得SaNHX1蛋白是一個典型的跨膜轉運蛋白,預測其含有11個跨膜結構域(圖3),這一結果與之前的報道[4,14]是一致的。將克隆到的基因序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對,結果發(fā)現(xiàn),其與蘆葦、玉米、水稻等的Na+/H+逆向轉運蛋白NHX親緣關系相近,相似性依次為94%、92%、91%。取高度相似(相似度>70%)的部分同源序列,使用Clustal X軟件進行同源序列比對,結果發(fā)現(xiàn)NHX1 蛋白序列具有高度保守區(qū),且在 SaNHX1 蛋白上含有NHX抑制劑氨氯吡嗪脒結合位點 [15]及糖基化位點(圖4)。從構建的NJ系統(tǒng)進化樹(圖5)上可以看到NHX主要分為兩大類,一類是定位于液泡膜上的蛋白,如AtNHX1、AtNHX2等;另一類是定位于質膜上的蛋白,如AtNHX5、AtNHX6,其中SaNHX1蛋白歸屬于液泡膜蛋白。同時定位到液泡膜上的蛋白又分為單子葉與雙子葉兩類,這說明單子葉植物和雙子葉植物的NHX在進化上存在差異[16],其中SaNHX1蛋白與單子葉植物的NHX蛋白親緣關系較近。[FL)]

    3結論與討論

    隨著土壤鹽漬化的加重,Na+/H+逆向轉運蛋白對于植物抵抗外界鹽漬環(huán)境具有非常重要的意義。本試驗從鹽生植物互花米草中克隆得到了編碼液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的基因,對其編碼的蛋白質預測結果顯示,SaNHX1具有典型的跨膜結構域,且跨膜區(qū)數(shù)目與之前的報道一致,同時該蛋白上還存在NHX抑制劑氨氯吡嗪脒結合位點及糖基化位點,這些都是NHX的重要特性。系統(tǒng)進化分析表明,SaNHX1屬于液泡膜型NHX,而且與單子葉植物聚為一類,這表明單子葉植物與雙子葉植物NHX在進化上可能存在著一為進一步探討互花米草的耐鹽機制,本研究利用熒光實時定量PCR儀對互花米草在NaCl 及ABA不同脅迫時間條件下,其[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]表達量進行分析。研究結果顯示,無論是在鹽脅迫下,還是在ABA脅迫下,[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的表達量都發(fā)生了定的差異。

    [CM(24]很大的變化,這說明在這2種脅迫下

    目前,隨著土壤鹽漬化問題地日益加重,依靠分子生物學手段來克隆相關耐鹽基因[17-18],并將其轉移到非抗鹽的作物中,以培育出耐鹽的轉基因新品種顯得尤為重要,這不僅可以在一定程度上開發(fā)利用鹽堿土地,而且對于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有非常重要的意義。目前關于[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的過量表達試驗正在進行中。

    參考文獻:

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    [11]邊晨凱,龍定沛,劉雪琴,等. 桑樹 Na+/H+逆向轉運蛋白基因([WTBX][STBX]MnNHX1[WTBZ][STBZ])的克隆與耐鹽力表達[J]. 林業(yè)科學,2015,51(8):16-25.

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