液相色譜-質(zhì)譜法測定血清中左乙拉西坦含量

帥放文，王向峰，雷玉萍，肖江，帥海濤

(湖南省藥用輔料工程技術(shù)研究中心有限公司，長沙 410331)

液相色譜-質(zhì)譜法測定血清中左乙拉西坦含量

帥放文，王向峰，雷玉萍，肖江，帥海濤

(湖南省藥用輔料工程技術(shù)研究中心有限公司，長沙 410331)

建立測定血清中左乙拉西坦?jié)舛鹊囊合嗌V-質(zhì)譜方法。血清樣品用甲醇提取，離心分離除去蛋白，采用液相色譜-質(zhì)譜法測定其中左乙拉西坦的含量。流動相為甲醇-0.1%甲酸(體積比為80∶20)，色譜柱為Agilent C18柱(100 mm×4.6 mm，3.5μm)。左乙拉西坦含量在1 000～100 000 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r2=0.999，檢出限為10 ng/mL。測定結(jié)果的相對標準偏差為0.93%(n=6)，樣品加標回收率為99.4%～101.3%。該方法具有較高的靈敏度、準確度和良好的精密度，適合血清中左乙拉西坦含量的測定。

液相色譜-質(zhì)譜；血清；左乙拉西坦

左乙拉西坦［1-2］[levetiracetam，化學(xué)名為(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺]是一種乙酰吡咯烷類化合物，結(jié)構(gòu)式見圖1。作為一種廣譜抗癲癇藥物［3-5］，左乙拉西坦具有耐受性好、高效、不良反應(yīng)少、藥物之間相互作用小、具有較好的藥代動力學(xué)［6-8］等特點。它由比利時UCB制藥公司開發(fā)，2000年4月作為新型抗癲癇藥物首次在美國上市，在歐美地區(qū)已被廣泛使用，具有廣闊的市場前景。

圖1 左乙拉西坦結(jié)構(gòu)式

目前測定左乙拉西坦血藥濃度的方法主要為高效液相色譜法(HPLC-UV)［9-14］，國外現(xiàn)行藥典［15-16］收錄了其質(zhì)量標準，其有關(guān)物質(zhì)的分析方法均采用液相色譜法，但由于其紫外最大吸收波長為末端吸收，基線波動較大，檢測限較高。筆者采用分析時間短、靈敏度高的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對血藥中微量的左乙拉西坦進行測定，此方法還可以為左乙拉西坦溶液和可能出現(xiàn)的雜質(zhì)提供定性分析，為臨床安全、有效、合理用藥提供基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：ABI 3200 Q Trap型，美國AB Sciex公司；

左乙拉西坦標準品：純度為100%，加拿大TRC公司；

甲醇：色譜純；

實驗所用其它試劑為分析純；

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent C18柱 (100 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國安捷倫公司)；柱溫：40℃；流動相：甲醇-0.1%甲酸(體積比為80∶20)；流量：0.5 mL/min；進樣體積：10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

氣簾氣：68.95 kPa(10 psi)；離子源電壓：4 500 V；離子源溫度：600℃；霧化氣：241.325 kPa(35 psi)；輔助氣：344.75 kPa(50 psi)；去簇電壓：344.75 kPa(50 psi)；入口電壓：68.95 kPa(10 psi)。

1.3 實驗方法

精密量取血清2 mL，加入甲醇8 mL，漩渦震蕩1 min，離心5 min，取上清液10 μL進樣分析。采用外標法，以峰面積定量。

1.4 左乙拉西坦標準儲備溶液的配制

精密稱取左乙拉西坦標準品10 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至標線，制得0.1 mg/mL的左乙拉西坦標準儲備溶液，置冰箱中于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的選擇

2.1.1 流動相的優(yōu)化

分別以甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相進行考察。甲醇-水作為流動相時，峰型出現(xiàn)拖尾，故加入一定量的甲酸，抑制其拖尾。因此選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。此外還考察了流動相比例、流速、柱溫條件，發(fā)現(xiàn)這些因素對色譜峰分離及峰形無明顯影響，為縮短分析時間，最終選擇流動相比例為80∶20，流速為0.5 mL/min，柱溫為40℃。

2.1.2 離子化模式選擇

左乙拉西坦帶有—NH2基團，故正離子模式響應(yīng)強于負離子模式。分別考察正負離子模式對左乙拉西坦質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果表明左乙拉西坦在負離子模式下響應(yīng)較低，不適合用于分析，因此選擇正離子模式檢測。

2.2 定性分析

在ESI正離子源下，對樣品進行全掃描，利用特征碎片離子對化合物進行定性，質(zhì)譜圖見圖2。由圖2可知，基峰m/z=193.2為該化合物與1個鈉離子結(jié)合得到的[M+Na]+離子峰；m/z=126.2，為該化合物丟失酰胺碎片得到的[M—(—C=O—NH2)]+離子峰。故可知該化合物的相對分子質(zhì)量為170.2，與左乙拉西坦的相對分子質(zhì)量一致。

圖2 左乙拉西坦質(zhì)譜圖

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

將無藥血清作為空白血清，對空白血清與加入標準品溶液的血清分別進樣測定，空白血清及其加標色譜圖分別見圖3、圖4。由圖3、圖4可知，血清內(nèi)源性成分不干擾左乙拉西坦的測定

圖3 空白血清色譜圖

圖4 加標血清樣品色譜圖

2.4 穩(wěn)定性試驗

在空白血清中，分別加入左乙拉西坦標準溶液，配制成10，30，50 μg/mL的血清樣品，將其置冰箱中于-30℃保存，隔1天取出，置于室溫條件下解凍，當其完全融化后，再放入冰箱中于-30℃保存，反復(fù)凍融3次，每次融化后對樣品進行測定，結(jié)果見表1。

表1 加標血清樣品測定結(jié)果

由表1可知，凍融3次前后，血清中左乙拉西坦含量無明顯變化，說明該樣品穩(wěn)定性較好。

2.5 標準曲線及檢測限

配制血清中左乙拉西坦質(zhì)量濃度分別為1 000，5 000，10 000，50 000，100 000 ng/mL的系列標準工作溶液，分別進樣10 μL，測定其色譜峰面積，對標準工作溶液質(zhì)量濃度(x)與色譜峰面積(y)進行線性回歸，得線性方程為y=12 483x-3×107，線性相關(guān)系數(shù)r2=0.999，左乙拉西坦的質(zhì)量濃度在1 000～100 000 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以信噪比為3考察該藥物的檢出限，得血清中左乙拉西坦檢出限為10 ng/L。

2.6 精密度試驗

配制血藥濃度為10 μg/mL的左乙拉西坦標準樣品，精密量取10 μL進樣，連續(xù)進樣6次，測定其色譜峰面積，結(jié)果見表2。由表2可知，該方法精密度良好，能滿足左乙拉西坦的含量測定。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.7 回收試驗

將1.3配制的血清樣品取1 mL，分別置于3只2 mL容量瓶中，再分別加入0.12，0.2，0.28 mL左乙拉西坦標準溶液，用甲醇稀釋至標線，搖勻，配制成含高、中、低濃度各3份的樣品溶液。按實驗方法測定，回收試驗結(jié)果見表3。由表3可知，該方法具有較高的準確度。

表3 回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

采用液相色譜-質(zhì)譜法對血清中的左乙拉西坦進行定性定量測定。通過方法學(xué)驗證，該方法具有簡便快速、靈敏度高等特點，為血清中的左乙拉西坦含量監(jiān)測提供了新的分析手段。同比《美國藥典》和《歐洲藥典》的液相色譜法，本方法具有分析時間短(2.1 min)，檢出限(10 ng/mL)低等特點，可用于臨床血清中左乙拉西坦含量的監(jiān)測。

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2015全國化學(xué)分析計量技術(shù)研討會于青島召開

2015年8月26-28日，“2015全國化學(xué)分析計量技術(shù)研討會”在山東青島市召開。本次會議由中國儀器儀表學(xué)會分析儀器分會、國防科技工業(yè)應(yīng)用化學(xué)一級計量站、兵器工業(yè)非金屬材料理化檢測中心聯(lián)合主辦，《化學(xué)分析計量》雜志社承辦。中國儀器儀表學(xué)會分析儀器分會理事長關(guān)亞風(fēng)出席會議，10余位專家學(xué)者進行了大會報告，參會代表對大會報告反應(yīng)熱烈。

（化學(xué)分析計量雜志社）

Determination of Levetiracetam in Serum by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Shuai Fangwen, Wang Xiangfeng, Lei Yuping, Xiao Jiang, Shuai Haitao
(Excipients Hunan Provincial Engineering Technology Research Center Limited Company, Changsha 410331, China)

A method of liquid chromatography-mass spectrometry for determination of levetiracetam concentrations in serum was established. The sample was deproteinized with methanol, and then levetiracetam concentrations in serum was determined by liquid chromatography-mass spectrometry with Agilent C18column(100 mm×4.6 mm，3.5μm) and mobile phase consisted of methanol-0.1% formic acid(volume ratio was 80∶20). The content of levetiracetam had good linear relationship with the chromatographic peak area in the range of 1 000-100 000 ng/mL，and the linear correlation coefficientr2=0.999. The detection limit was 10 ng/mL. The relative standard deviation of determination results was 0.93%(n=6), and the recoveries of standard addition were 99.4%-101.3%. This method was suitable for detecting levetiracetam in serum with advantages of good precise，high accuracy and sensitivity.

liquid chromatography-mass spectrometry; serum; levetiracetam

O657.7

：A

：1008-6145(2015)05-0072-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2015.05.019

聯(lián)系人：帥海濤；E-mail: 617215816@qq.com

2015-05-03