蒸發(fā)光散射高效液相色譜法測定黃芪飲片中的黃芪甲苷含量

荀其寧，侯倩倩，劉志娟，許峰，張文申，劉霞，冀克儉

(中國兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，濟(jì)南 250031 )

蒸發(fā)光散射高效液相色譜法測定黃芪飲片中的黃芪甲苷含量

荀其寧，侯倩倩，劉志娟，許峰，張文申，劉霞，冀克儉

(中國兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，濟(jì)南 250031 )

采用蒸發(fā)光散射高效液相色譜法測定黃芪飲片中黃芪甲苷的含量。黃芪飲片分別用甲醇和正丁醇提取，以NaOH溶液洗滌，蒸干，再用甲醇溶解，采用Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)分離測定，流動(dòng)相為乙腈-水(32∶68)，流量為1.0 mL/min，漂移管溫度為80℃。方法檢出限為1.5 μg/mL，黃芪甲苷溶液的質(zhì)量濃度在2～12 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好(r2=0.999 6)，測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%（n=6），平均加標(biāo)回收率為99.6%。該方法穩(wěn)定可靠，可用于黃芪藥材及其生物制品中黃芪甲苷含量的測定。

黃芪；黃芪甲苷；液相色譜；蒸發(fā)光散射檢測器

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，味甘，性微溫，具有清熱燥濕、補(bǔ)氣固表、利尿脫毒排膿、斂瘡生肌之功效［1］。黃芪含皂苷、黃酮、多糖及氨基酸等多種化學(xué)成分，其中黃芪甲苷為黃芪中的主要活性成分，是黃芪藥材及其制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分［2-5］。黃芪收載于《中國藥典》2010版（一部）。

黃芪甲苷常用的含量測定方法有薄層掃描法和高效液相色譜法。薄層掃描法操作繁瑣，測定結(jié)果重現(xiàn)性差。常規(guī)的高效液相色譜-紫外檢測器不適用于黃芪甲苷的檢測，因?yàn)辄S芪甲苷僅在200 nm左右有微弱的吸收，檢測靈敏度低，噪音大［6-9］。而蒸發(fā)光散射檢測器對(duì)黃芪甲苷具有較高的檢測靈敏度，在實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用［10-16］。筆者對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行優(yōu)化處理，建立了一種準(zhǔn)確可靠的黃芪甲苷含量測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent 1260型，配有蒸發(fā)光散射檢測器，美國安捷倫科技有限公司；

分析天平：ABS135-S型，美國梅特勒-托利多公司；

超聲波清洗器：KQ5200型，昆山市超聲儀器有限公司；

甲醇、乙醇：色譜純，美國Fisher Scientific公司；

正丁醇：分析純，山東萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；

氫氧化鈉：分析純，天津天大化工實(shí)驗(yàn)室；

高純氮?dú)猓杭兌葹?9.999%，濟(jì)南堯天儀器有限公司；

黃芪甲苷對(duì)照品：編號(hào)為110781，純度為95.8%，中國食品藥品檢定研究所；

黃芪飲片樣品：市售；

實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(體積比為32∶68)，流量為1.0 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：20 μL；噴霧器溫度：60℃；漂移管溫度：80℃。

1.3 溶液的配制

1.3.1 黃芪甲苷對(duì)照品溶液

精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品5 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至標(biāo)線，搖勻即得。

1.3.2 黃芪飲片樣品溶液

取黃芪飲片適量，于50℃干燥至恒重，用研缽研磨成粉，過380 μm（40目）篩。取4 g粉末，置于索氏提取器中，加入40 mL甲醇，冷浸過夜。隔天加甲醇適量，加熱回流4 h，將提取液回收并濃縮至干。殘?jiān)铀?0 mL，微熱使其溶解，分別用40 mL水飽和的正丁醇振搖提取4次后合并正丁醇液。分別用40 mL 1% NaOH溶液（替代藥典方法中的氨試液）充分洗滌2次，棄去1% NaOH溶液，將正丁醇液蒸干。加水5 mL溶解殘?jiān)?，放冷，注入D101型大孔吸附樹脂柱（12 cm×1.5 cm），以50 mL水洗脫，棄去，然后用30 mL 40%乙醇洗脫，棄去，再用80 mL 70%乙醇洗脫，棄去。蒸干后殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，搖勻，用0.45μm濾膜濾過，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法

黃芪飲片樣品的前處理對(duì)含量測定影響較大，注意事項(xiàng)主要包括：（1）用索氏提取器提取時(shí)，供試品需全部浸泡在甲醇中，約20 min虹吸一次，加熱回流6 h；（2）用水飽和正丁醇振搖提取時(shí)，采用分液漏斗，每次至少30 min，分離液體速度要慢；（3）用D101型大孔吸附樹脂柱洗脫時(shí)，洗脫過程要保持慢速，保證前一種洗脫液完全流出時(shí)再加入另一種洗脫液；（4）對(duì)氨試液及1% NaOH溶液的去雜效果進(jìn)行了試驗(yàn)比較，通過處理后樣品比較及色譜分析，結(jié)果表明，1% NaOH溶液能更好地去除樣品中黃酮等含酚羥基等酸性雜質(zhì)，洗滌效果更好。

2.2 色譜條件的確定

2.2.1 色譜柱

比較了Agilent SB-C18柱、Agilent TC-C18柱和Agilent Bonus-RP柱，結(jié)果表明，采用Agilent SB-C18柱時(shí)黃芪甲苷的分離度好，而且色譜峰形尖銳對(duì)稱，故實(shí)驗(yàn)采用Agilent SB-C18柱。

2.2.2 流動(dòng)相

分別以甲醇-水(80∶20)和乙腈-水(32∶68)為流動(dòng)相考察供試品溶液中各組分的分離情況。結(jié)果表明，以甲醇-水(80∶20)為流動(dòng)相時(shí)，黃芪甲苷出峰慢，而且與其它組分的色譜峰不能完全分離；而以乙腈-水(32∶68)為流動(dòng)相時(shí)，黃芪甲苷與其它組分分離良好。故選用乙腈-水(32∶68)為流動(dòng)相。

在1.2色譜條件下，黃芪甲苷對(duì)照品溶液及樣品加標(biāo)溶液色譜圖分別見圖1、圖2。由圖1、圖2可知，黃芪飲片樣品中，黃芪甲苷與其它組分分離良好，色譜峰形尖銳對(duì)稱，適于用作定量分析。

圖1 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 黃芪飲片樣品溶液色譜圖

2.3 線性方程和檢出限

分別精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液10，20，30，40，50，60 μL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，進(jìn)樣20 μL，以對(duì)照品色譜峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=1.544 4x+10.145 3，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 6，結(jié)果表明，黃芪甲苷在2～12 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

逐步稀釋黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在1.2色譜條件下進(jìn)行測定，根據(jù)被測組分在氣相色譜上的信噪比（S/N）為3確定檢出限為1.5 μg/mL；以信噪比10計(jì)算定量限，結(jié)果為7.5 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

將黃芪飲片溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，黃芪甲苷色譜峰面積測定結(jié)果見表1。由表1可知，色譜峰面積測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%，表明本方法精密度良好。

表1 色譜峰面積測定結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱定黃芪飲片9份，根據(jù)1.3.2配制樣品溶液，精確加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.8，1.0，1.2 mL各3份，用甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，作為樣品溶液，依法測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。由表2可知，黃芪甲苷的平均回收率為99.6%，表明本法準(zhǔn)確度較高。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

采用蒸發(fā)光散射高效液相色譜法測定黃芪飲片中黃芪甲苷的含量，具有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，可用于黃芪及其制劑中黃芪甲苷的含量分析。

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Determination of Astragaloside Ⅳ in Astragalus Decoction Pieces by HPLC-ELSD

Xun Qining, Hou Qianqian, Liu Zhijuan, Xu Feng, Zhang Wenshen, Liu Xia, Ji Kejian
（CNGC Institute53, Jinan 250031, China）

HPLC-ELSD method was used to determine astragaloside Ⅳ in astraglus decoction pieces. The sample of astragalous decoction pieces was extracted by methanol andn-butyl alchol, after cleaning with NaOH solution, the sample was dried and disolved in methanol, and was determined by Agilent SB-C18column (250 mm×4.6 mm, 5μm), acetonitrile-water(32∶68) was as the mobile with the flow rate of 1.0 mL/min, the drifttube temperature was 80℃. The detection limit of the method was 1.5 μg/mL. The linear range was 2-12 μg/mL(r2=0.999 6). The RSD of determination results was 0.65%(n=6). The average recovery of astragaloside Ⅳ was 99.6%. This method is accurate, reliable and with good reproducibility, and it can be used for the determination of astragaloside Ⅳ in Radix Astragali and its products.

astragalous decoction pieces;astragaloside IV; HPLC; ELSD

O657.7

：A

：1008-6145(2015)05-0062-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2015.05.016

聯(lián)系人：侯倩倩；E-mail: houqianqian53@163.com

2015-08-04