象皮生肌膏對(duì)大鼠Ⅲ期壓瘡新生肉芽組織中TGF-β、FN含量的影響

張?jiān)戮辏钅厩?，王小亮，趙 鴻

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湘杏學(xué)院，湖南 長沙 410007）

象皮生肌膏對(duì)大鼠Ⅲ期壓瘡新生肉芽組織中TGF-β、FN含量的影響

張?jiān)戮?，李木清2*，王小亮1，趙 鴻1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湘杏學(xué)院，湖南 長沙 410007）

目的 研究象皮生肌膏對(duì)壓瘡大鼠新生肉芽組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及纖維結(jié)合蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)含量的影響。方法 180只大鼠中隨機(jī)取30只大鼠作為空白對(duì)照組，對(duì)其余150只大鼠進(jìn)行壓瘡造模，再隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組30只，模型組予生理鹽水紗布外敷，陽性對(duì)照組予康惠爾潰瘍貼外敷，實(shí)驗(yàn)組予象皮生肌膏外敷。治療后的第7、14、21天每組分別隨機(jī)選取10只大鼠處死并取相同部位創(chuàng)傷組織制切片，用免疫組化檢測TGF-β及FN含量，同時(shí)觀察三組創(chuàng)面愈合率。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組愈合所需時(shí)間最短、愈合率最高，TGF-β含量在第7天最高且達(dá)峰值，F(xiàn)N含量在第14天最高且達(dá)峰值；實(shí)驗(yàn)組與模型組及陽性對(duì)照組在第7天、第14天TGF-β含量、FN含量及創(chuàng)面愈合率間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 象皮生肌膏能促進(jìn)壓瘡大鼠新生肉芽組織中TGF-β及FN的表達(dá)，提高創(chuàng)面愈合率，從而促進(jìn)傷口愈合。

象皮生肌膏；轉(zhuǎn)化生長因子-β；纖維結(jié)合蛋白；壓瘡模型大鼠；象皮粉；當(dāng)歸

壓瘡是臨床上常見的并發(fā)癥之一，主要見于長期臥床或癱瘓的病人[1]。由于患者身體局部長期受壓，導(dǎo)致局部血液循環(huán)障礙而使相應(yīng)皮下組織缺血缺氧，若不及時(shí)診治，患者可能出現(xiàn)嚴(yán)重感染、甚至全身衰竭而危及生命[2]。象皮生肌膏能有效縮短壓瘡創(chuàng)面愈合時(shí)間[3]，提高臨床療效。本文研究象皮生肌膏對(duì)壓瘡大鼠新生肉芽組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及纖維結(jié)合蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD成年健康SPF級(jí)大鼠180只，雄性，體質(zhì)量（260.6±19.3）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK湘2011—0003。分籠喂養(yǎng)，室溫保持在24～26℃左右，濕度保持在50%左右，自由飲水及進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑 鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β及纖維結(jié)合蛋白ELISA檢測試劑盒來自北京杰輝博高生物科技有限公司。

1.1.3 藥物 生理鹽水，10%水合氯醛 （上海盛利泰化有限公司）；康惠爾潰瘍貼[康樂保(中國)有限公司，批號(hào)：2640124]；青霉素 （華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F3082108）；象皮生肌膏（湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院藥劑科自制，湘藥制字Z20070276，批號(hào)：20120918）。

1.1.4 儀器 圓片形磁片(直徑16 mm，厚2 mm)由上海黃浦區(qū)東飛機(jī)電五金經(jīng)營部提供，磁片表面的磁通量為1500 GS。DM LB2型雙目顯微鏡 （德國LEICA公司）；MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) （北航公司）；Shandon325型石蠟切片機(jī) （英國生產(chǎn)）；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模 選取SD成年健康SPF級(jí)大鼠150只。大鼠模型的建立參照Peirce、Wassermann E等埋置鐵片加外用磁鐵施壓的造模方法[4-5]和葛良鵬等[6]埋置磁片加外用磁鐵施壓的造模方法。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日稱質(zhì)量，造模8 h禁水和禁食，術(shù)前肌肉注射8～ 10 IU的青霉素進(jìn)行預(yù)防治療，然后以10%水合氯醛(300 mg／kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉；對(duì)大鼠大腿造模區(qū)進(jìn)行脫毛、消毒、干燥。最后采用亞甲藍(lán)在大鼠右大腿作直徑17 mm的圓形標(biāo)記，用手術(shù)刀沿圓形標(biāo)記做一深至筋膜的切口，鈍性分離，將磁片植入大腿部皮下然后縫合，體外采用磁鐵間歇性施加壓力。通過外源磁片與體內(nèi)移植磁片相吸，對(duì)局部皮膚產(chǎn)生擠壓力，造成局部皮膚缺血，持續(xù)2 h后，將外源磁片移開；休息30 min后，再將外源性磁片移至內(nèi)源性磁片之上，持續(xù)2 h后，再將外源性磁片移開，如此循環(huán)。每只大鼠每日連續(xù)3個(gè)循環(huán)，持續(xù)4 d。以大鼠大腿手術(shù)區(qū)皮膚失去全層皮膚組織，骨、肌腱或肌肉尚未暴露作為判斷Ⅲ期壓瘡的標(biāo)準(zhǔn)[7]。期間每只大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食，切口噴灑青霉素溶液預(yù)防感染。最后成功造模Ⅲ期壓瘡大鼠136只。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組方法 30只大鼠作為空白對(duì)照組，造模成功大鼠，選取90只，隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組30只。

1.2.3 治療方法 4組大鼠分別單籠喂養(yǎng)，換藥前均先用無菌生理鹽水進(jìn)行清創(chuàng)，再以1%碘伏消毒，最后以無菌干燥紗布對(duì)大鼠局部干燥。模型組予生理鹽水紗布外敷，陽性對(duì)照組予康惠爾潰瘍貼外敷，實(shí)驗(yàn)組予象皮生肌膏外敷。4組每天均換藥1次。

1.2.4 觀測指標(biāo)及方法 （1）創(chuàng)面TGF-β及FN表達(dá)檢測 分別于治療后的第7、14、21天從每組隨機(jī)選取10只大鼠處死并取相同部位創(chuàng)緣組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟切片，采用免疫組化檢測TGF-β及FN表達(dá)的含量，免疫組化結(jié)果測定：陽性染色為棕色顆粒，定位于胞漿和／或胞膜。以APP8.0圖像分析軟件進(jìn)行光密度的測量。顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。（2）肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況 分別在治療后的第7、14、21天用數(shù)碼相機(jī)對(duì)大鼠創(chuàng)面照相，采用圖像分析IPP軟件計(jì)算未愈合面積、創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠創(chuàng)面TGF-β表達(dá)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組在第7、14、21天TGF-β陽性表達(dá)都高于模型組（P＜0.01），并高于陽性對(duì)照組（P＜0.01）；陽性對(duì)照組在第7、14、21天TGF-β陽性表達(dá)都高于模型組（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 4組創(chuàng)面TGF-β表達(dá)的光密度比較 （±s，n=10）

表1 4組創(chuàng)面TGF-β表達(dá)的光密度比較 （±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較△P＜0.05；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對(duì)照組比較#P＜0.05。下表同。

組別空白對(duì)照組模型組陽性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組第7天90.53±17.92 172.4±17.42△215.6±17.73* 269.3±16.84**#第14天90.01±15.12 148.3±16.42△174.9±16.06* 207.5±16.48**#第21天90.79±20.03 108.3±14.21△138.3±15.08* 172.5±15.57**#

圖1 創(chuàng)面中富含TGF-β的纖維細(xì)胞分布顯微圖（免疫組化×400）

2.2 4組大鼠創(chuàng)面FN表達(dá)的比較

實(shí)驗(yàn)組在第7、14、21天FN陽性表達(dá)都高于模型組（P＜0.01），并高于陽性對(duì)照組（P＜0.01）；陽性對(duì)照組在第7、14、21天TGF-β陽性表達(dá)均高于模型組（P＜0.05）。見表2，圖2。

表2 4組創(chuàng)面FN表達(dá)的光密度比較 （±s，n=10）

表2 4組創(chuàng)面FN表達(dá)的光密度比較 （±s，n=10）

組別空白對(duì)照組模型組陽性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組第7天100.7±9.74 178.1±10.52△199.2±10.41* 299.8±12.93**#第14天99.8±10.43 248.3±9.74△304.5±9.81* 490.6±17.63**#第21天100.9±10.11 298.5±13.03△385.5±13.32* 243.5±11.43**#

2.3 創(chuàng)面肉眼觀察及愈合率的比較

肉眼觀察 （1）實(shí)驗(yàn)組：大鼠切割后創(chuàng)面滲出液較多，肉芽迅速生長，呈淡紅鮮艷色。肉眼觀術(shù)后第3天創(chuàng)面開始愈合，第14天基本愈合，第21天完全愈合。（2）陽性對(duì)照組：大鼠切割后創(chuàng)面濕潤，肉芽生長較緩，色較暗。肉眼觀術(shù)后第5天開始愈合，第21天仍未全部愈合。（3）模型組：大鼠切割后創(chuàng)面較干燥，色暗。肉眼觀術(shù)后第7天開始愈合，直到第21天愈合率仍然很低。（4）空白對(duì)照組：無變化。所有動(dòng)物創(chuàng)面均未見明顯感染跡象。

圖2 創(chuàng)面中富含F(xiàn)N的纖維細(xì)胞分布顯微圖（免疫組化×400）

愈合率的比較 實(shí)驗(yàn)組在第7、14、21天愈合率都高于模型組（P＜0.01），且高于陽性對(duì)照組（P＜0.05）；陽性對(duì)照組在第7、14、21天愈合率都高于模型組TGF-β陽性表（P＜0.05）。見表3。

表3 3組潰瘍創(chuàng)面動(dòng)態(tài)愈合率比較 （±s，n=10，%）

表3 3組潰瘍創(chuàng)面動(dòng)態(tài)愈合率比較 （±s，n=10，%）

組別模型組陽性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組第7天32.7±3.2 42.4±4.6* 54.8±4.5**#第14天58.7±4.9 76.5±4.6* 85.6±4.9**#第21天76.8±5.0 92.4±2.9* 100.0**#

3 討論

壓瘡，主要是因?yàn)榫植拷M織長時(shí)間受壓，導(dǎo)致相應(yīng)組織缺血缺氧而使皮下發(fā)生病損的一種并發(fā)癥。而當(dāng)血液重新恢復(fù)后，可能加重機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞和組織細(xì)胞膜再灌注損傷[7]。在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，壓瘡屬“褥瘡”范疇，認(rèn)為主要病因是久病臥床，導(dǎo)致氣血不和、血運(yùn)不暢，久之則肌膚失養(yǎng)而導(dǎo)致皮膚潰爛；或者因?yàn)殚L期臥床局部摩擦而導(dǎo)致皮膚破損而發(fā)病。治療上主要以益氣、活血、通絡(luò)、消腫、生肌為主。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠Ⅲ期壓瘡成功造模，然后免疫組化檢測轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）及纖維結(jié)合蛋白（FN）的分子生物表達(dá)及創(chuàng)面愈合率來評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合效果，具有實(shí)際臨床指導(dǎo)意義。

TGF-β是一類具有多功能的細(xì)胞因子，是由多組織細(xì)胞所合成的，對(duì)細(xì)胞周期具有調(diào)控作用，能夠影響細(xì)胞的分裂[8]；一般處于無活性的狀態(tài)，當(dāng)組織損傷時(shí)能激活，TGF-β被釋放出來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。其生物學(xué)效應(yīng)主要通過抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性，促進(jìn)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)前膠原蛋白Ⅰ及纖維素結(jié)合素合成，從而增加膜受體、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，驅(qū)使炎性因子向損傷部位移動(dòng)，進(jìn)而誘導(dǎo)新生肉芽組織生成，加速組織的修復(fù)[10]。本研究在第一天就檢測到了TGF-β，說明TGF-β在細(xì)胞開始修復(fù)時(shí)就發(fā)揮了其作用，在第7天達(dá)到峰值，這和Rong報(bào)道的一致[11]。模型組，陽性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組TGF-β含量表達(dá)的比較，顯示模型組含量在壓瘡愈合各階段都表達(dá)的最少；陽性對(duì)照組含量在壓瘡愈合各階段都表達(dá)的比模型組多，比實(shí)驗(yàn)組少；實(shí)驗(yàn)組含量在壓瘡愈合各階段都表達(dá)的最多。FN主要由血管上皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞產(chǎn)生，是一種能維持機(jī)體的完整性和具有防御功能的物質(zhì)，廣泛存在于體液、細(xì)胞表面及結(jié)締組織，主要通過其位點(diǎn)與纖維蛋白原、膠原纖維結(jié)合，形成富含F(xiàn)N的基層膠原纖維-纖維蛋白復(fù)合物，同時(shí)在創(chuàng)緣上皮進(jìn)行增殖，直至上皮化愈合。FN特別是在皮膚中存在于基膜與相鄰細(xì)胞間的界面上，在傷口修復(fù)愈合中起重要作用[12]。正如本實(shí)驗(yàn)研究顯示：三組大鼠TGF-β及FN的在創(chuàng)面不同時(shí)間段都存在不同程度的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組壓瘡創(chuàng)面愈合率顯著高于模型組和陽性對(duì)照組。說明 TGF-β和FN在壓瘡創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：象皮生肌膏組愈合所需時(shí)間最短，TGF-β與FN含量分別在第7天、14天最高且達(dá)峰值，說明對(duì)于壓瘡損傷大鼠，象皮生肌膏能促進(jìn)新生肉芽組織中TGF-β及FN的表達(dá)，從而促進(jìn)傷口愈合。

象皮生肌膏組方出自于張山雷《瘍科綱要》，是中醫(yī)外科具有生肌長皮作用的外用藥物之一，具有防腐收斂、生肌斂瘡、活血止痛、驅(qū)痹填髓長肉、抗炎抗感染、清熱瀉火解毒之功效。實(shí)驗(yàn)所用象皮生肌膏為湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院藥劑科自制藥，配方為：象皮粉、當(dāng)歸、生地、生石膏、血余炭、黃蠟、爐甘石、白蠟、龜板、麻油。象皮生肌膏用于壓瘡的治療，能有效加速傷口愈合、縮短治療周期、減輕患者疼痛和不適，本研究為象皮生肌膏進(jìn)一步的臨床推廣應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Xiangpi Shengji Cream on TGF-β and FN in New Granulation Tissue of Rats with Phase III Pressure Ulcers

Yue-Juan Zhang1,Mu-Qing Li2*,Xiao-Liang Wang1,Hong Zhao1
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;
2.Xiangxing College,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To study the effects of Xingpi Shengji cream on TGF-β and FN in new granulation tissue of rats with phase III pressure ulcers.Methods 30 rats from the 180 rats were randomly selected as the blank control group, the other 150 rats were made model of pressure ulcer.The 150 healthy rats were randomly divided into model group, positive control group and experimental group,with 30 rats in each group.The model group was given physiological saline gauze application,the positive control group was treated with comfeel ulcer paste,and the experimental group was treated by external application of elephantiasis myogenic cream.10 rats after treatment of 7 days,14 days and 21 days in each group were randomly selected,and were put to death and take the same parts organization made into slices.The expression of TGF-β and FN was detected by immunohistochemistry and the wound healing rate of three groups at the same time was observed.Results The experimental group was with the shortest healing time and the highest rate of healing.The content of TGF-β and FN,and the wound healing rate at 7 days and 14 days of the experiment group,model group and positive control group were statistically significant(P＜0.05).Conclusion The Xiangpi Shengji cream could promote the expression of TGF-β and FN in new granulation tissue of rats with pressure ulcers.It can improve the wound healing rate to promote wound healing.

Xiangpi Shengji cream;TGF-β;FN;pressure ulcers model rats;Xiangpi powder;Angelica sinensis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.07.003

2015-04-11

湖南省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2012FJ4354）。

張?jiān)戮?，女，教授，主任護(hù)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)護(hù)理學(xué)。

*李木清，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：zyjhulibu@163.com。