東北朝鮮族泡菜中乳酸菌的分離鑒定*

何文兵，慈 慧，張美娟

(1.通化師范學(xué)院 制藥與食品科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002；2.通化師范學(xué)院長白山食品工程研究中心，吉林 通化 134002；

3.通化市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林 通化 134002)

東北朝鮮族泡菜中乳酸菌的分離鑒定*

何文兵1,2，慈 慧3，張美娟1

(1.通化師范學(xué)院 制藥與食品科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002；2.通化師范學(xué)院長白山食品工程研究中心，吉林 通化 134002；

3.通化市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林 通化 134002)

以朝鮮族泡菜為原料從中篩選乳酸菌，通過對形態(tài)特征、生理生化等進(jìn)行初步鑒定，從中篩選出15株乳酸菌，以產(chǎn)酸速度快、亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)等指標(biāo)為依據(jù)，優(yōu)選出發(fā)酵性能好的5株乳酸菌：LB5、LB6、LB7、BC6、BC8．

乳酸菌；分離；鑒定

泡菜是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵制品，不同地域的產(chǎn)品不同，國內(nèi)尤以四川泡菜為典型，而東北地區(qū)的泡菜則以朝鮮族泡菜最具代表性．現(xiàn)代微生物學(xué)的發(fā)展, 進(jìn)一步揭示了乳酸菌對人體健康有益作用的機(jī)理[1]，使用乳酸菌發(fā)酵加工的泡菜引起了國內(nèi)外研究人員的重視．在泡菜的發(fā)酵過程中乳酸菌優(yōu)越的發(fā)酵性能夠縮短發(fā)酵的時間、提高泡菜的品質(zhì)、延長泡菜食用期，同時在降低亞硝酸鹽含量、防腐抑菌等方面都有重要作用[2]．本試驗(yàn)以朝鮮族泡菜“金剛山泡菜”為原料，研究東北地區(qū)朝鮮族泡菜中乳酸菌的多樣性，從中分離篩選優(yōu)勢乳酸菌，并結(jié)合當(dāng)?shù)氐馁Y源優(yōu)勢，應(yīng)用到長白山區(qū)山野菜泡菜產(chǎn)品的開發(fā)中，實(shí)現(xiàn)長白山地區(qū)山野菜資源的深加工，促進(jìn)當(dāng)?shù)刭Y源優(yōu)勢的有力轉(zhuǎn)化，服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)．

1 材料與方法

1.1 材料

LB：“金剛山”朝鮮族蘿卜泡菜；BC：“金剛山”朝鮮族白菜泡菜．

1.2 藥品及儀器

酵母膏，蛋白胨，酵母浸粉，牛肉浸粉，葡萄糖，檸檬酸二銨，硫酸鎂，瓊脂粉，磷酸氫二鉀，硫酸錳，乙酸鈉，吐溫80，碳酸鈣，亞硝酸鈉，氯化銨，乙酸，對氨基苯磺酸，鹽酸萘乙二胺，葡萄糖，無水碳酸鈣， 95%乙醇，氯化鈉，鹽酸，三氯化鐵；(以上化學(xué)試劑均為分析純)．

精密酸度計(jì)，NOSHP0101239131 (上海大譜儀器有限公司)；電子天平，MPZ1001 (上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；凈化工作臺，CWCJ-CJ系列 (上海恒平科技有限公司)；生化培養(yǎng)箱SPX-100B-2 (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；生物顯微鏡，B203LED (重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)；離心機(jī) TDL80-213(上海安享科學(xué)儀器廠制造)；立式壓力蒸汽滅菌器 TDL80-2B(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；空氣恒溫?fù)u床 KYC-100C(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；干燥箱DHG-9245A型(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱SPX-150B-Z (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；低溫冰箱BCD-186D (合肥美菱股份有限公司)；722分光光度計(jì)．

1.3 培養(yǎng)基的配制

MRS固體培養(yǎng)基[3]：蛋白胨 10g；牛肉浸粉 10g；酵母浸粉 5g；葡萄糖 20g；檸檬酸二銨2g；硫酸鎂0.58g；磷酸氫二鉀2g；硫酸錳0.25g；乙酸鈉5g；吐溫801mL；瓊脂粉15g；蒸餾水1000mL．調(diào)pH值6.2～6.4，121℃滅菌15min．MRS液體培養(yǎng)基[3]：蛋白胨 10g；牛肉浸粉 10g；酵母浸粉 5g；葡萄糖 20g；檸檬酸二銨2g；硫酸鎂0.58g；磷酸氫二鉀2g；硫酸錳0.25g；吐溫801mL；乙酸鈉5g；蒸餾水1000mL．調(diào)pH值6.2～6.4，121℃滅菌15min．

2 方法

2.1 乳酸菌分離純化及保藏

其流程為：泡菜樣品→乳酸菌分離→純化→乳酸菌的形態(tài)鑒定→生理生化鑒定→斜面保藏→增殖培養(yǎng)→亞硝酸的降解率→產(chǎn)酸定性鑒定→菌種保藏[4]．以無菌操作，定量稱取泡菜及汁，勻漿后放在滅菌的試管中用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，選取適宜的稀釋度，取1mL于培養(yǎng)皿中，以滅菌的45～50℃的加有2%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基傾倒平板，于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h，挑取有溶鈣圈的黃色單菌落，具有典型乳酸菌菌落特征的菌株進(jìn)行反復(fù)分離、純化至純菌落．將各菌株編號、保存待鑒定．

2.2 乳酸菌的鑒定

(1)乳酸菌的初步鑒定.形態(tài)鑒定方法[3,4]：取保存編號乳酸菌分別接種到MRS平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48h，取典型的菌落做革蘭氏染色，用顯微鏡觀察菌體特征．

生理生化試驗(yàn)[5]：鑒定方法，觸酶試驗(yàn)，用接種環(huán)挑取細(xì)菌置于潔凈的載玻片上，滴加3%～15%的過氧化氫溶液1滴，立即觀察結(jié)果，若有氣泡產(chǎn)生則細(xì)菌為陽性，若無氣泡產(chǎn)生則細(xì)菌為陰性．對革蘭氏染色陽性、觸酶試驗(yàn)陰性的菌落繼續(xù)于4℃條件下保藏．該環(huán)節(jié)以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌做對照．

(2)產(chǎn)酸速度實(shí)驗(yàn)[6].pH法測定產(chǎn)酸速度：取初步篩選完的乳酸菌活化后，用接種環(huán)輕輕挑一環(huán)接入已滅菌的10mL MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃下震蕩培養(yǎng)18h后，按1%的接種量取此菌懸液0.5mL接入50mL已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃下震蕩培養(yǎng)，并每隔2h取樣5mL測定其pH值，考察其對葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)酸作用．

(3)亞硝酸鹽降解實(shí)驗(yàn).分別吸取0、0.20、0.40、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50mL NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液(相當(dāng)于0μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg NaNO2)，分別置于50mL比色管中．在標(biāo)準(zhǔn)液與樣品液管中分別加入2mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5min后各加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液(2g·L-1)，加水至刻度，混勻，靜置15min，用2cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長538nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．取初步篩選完的乳酸菌活化后接入已滅菌的10mL MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃下震蕩培養(yǎng)18h后，按1%的接種量取此菌懸液1mL分別接入100mL已滅菌的含有NaNO2(10mg·L-1)的MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃震蕩培養(yǎng)72h．將含菌體的培養(yǎng)基用高速離心機(jī)3500r/s離心兩次，每次10min以去除菌體．采用鹽酸萘乙二胺法測定其亞硝酸鹽含量．

鹽酸萘乙二胺法[7]：吸取40mL上述濾液于50mL比色管中，加入2mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液搖勻．靜置3～5min后，加入1mL 0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液，并用蒸餾水定容到50mL,搖勻靜置15min后用分光光度計(jì)在538nm波長下測定吸光度，同時以不加NaNO2且不接種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基為對照．

表1 革蘭氏染色結(jié)果

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌的分離純化結(jié)果

從金剛山朝鮮族蘿卜泡菜中分離出7株乳酸菌，分別命名為LB1、LB2、LB3、LB4、LB5、LB6、LB7;從金剛山朝鮮族白菜泡菜中分離出8株乳酸菌，分別命名為BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC8．

3.2 革蘭氏染色結(jié)果

乳酸菌涉及到乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬等，其形態(tài)特征為革蘭氏染色陽性、無鞭毛．基于顯微鏡下菌體的顏色及形態(tài)，上述分離到的微生物初步被定性為乳酸菌(表1、圖1)．

圖1 不同來源的乳酸菌菌株油鏡觀察

3.3 接觸酶反應(yīng)結(jié)果[3]

分別對15個菌株進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)，觀察其是否產(chǎn)生氣體，并以此判定接觸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果．

表2 接觸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，LB3、LB4、LB5、LB6、LB7、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC8均為接觸酶陰性，符合乳酸菌的特性，所以將以上菌株保留．

3.4 產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 產(chǎn)酸速率曲線

由圖2可知，在12h的檢測中發(fā)現(xiàn)，pH值變化幅度較大的發(fā)酵液其菌種的產(chǎn)酸能力相對較強(qiáng)，即LB3、LB4、LB5、LB6、LB7、BC5、BC6、BC8產(chǎn)酸速率較好．其中由于BC2,BC3產(chǎn)酸速率不理想，所以將其淘汰．

3.5 亞硝酸鹽鹽降解結(jié)果

圖3 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

亞硝酸鹽含量在0～14ug之間，吸光度在0～0.2之間，據(jù)此繪制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)．通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的亞硝酸鹽含量．降解率等于培養(yǎng)基中NaNO2減少的量/10mg·L-1與未接菌的培養(yǎng)基中的NaNO2的含量/10mg·L-1之比乘100%．

表3 亞硝酸鹽降解率(%)

由表3可知，LB5、LB6、LB7、BC6、BC8的亞硝酸鹽降解率較好，其中LB3、LB4、LB6、BC5由于亞硝酸鹽降解率不好，所以將其淘汰．

4 結(jié)論與討論

經(jīng)革蘭氏染色、形態(tài)鑒定、接觸酶反應(yīng)等試驗(yàn)，從朝鮮族金剛山泡菜中分離到15株乳酸菌菌株，并以產(chǎn)酸速率，亞硝酸鹽降解能力等為指標(biāo)從中優(yōu)選出5株乳酸菌分別命名為LB5、LB6、LB7、BC6、BC8．同時發(fā)現(xiàn)來源于辣白菜中的菌株以球菌為主，而酸蘿卜中的乳酸菌以桿菌為主，表明不同的乳酸菌對底物的營養(yǎng)要求有區(qū)別．

作為優(yōu)化篩選的這5株乳酸菌將對其進(jìn)行后續(xù)的深入研究，并將其應(yīng)用到山野菜泡菜的發(fā)酵試驗(yàn)，以考察其對原料的適應(yīng)性，為后續(xù)產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)．

[1]Cherl- Ho L. Lactic acid fermented foods and their benefits in Asia[J]. Food Control, 1997, 8(5-6):259-269.

[2]楊雪.發(fā)酵蔬菜中乳酸菌的分離鑒定及其應(yīng)用研究[D].武漢:武漢工業(yè)學(xué)院,2008.

[3]蘇世彥.食品微生物檢驗(yàn)手冊[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1998.

[4]吳元鋒,鄒禮根.泡菜中乳酸菌的分離、鑒定及其發(fā)酵性能研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2007,7(5):42-46.

[5]凌代文,東秀珠.乳酸菌細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999.

[6]尹利端.幾種泡菜的安全性研究與優(yōu)良乳酸菌的分離、鑒定[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[7]中國標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室.中國食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編[M].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2001.

(責(zé)任編輯:陳衍峰)

10.13877/j.cnki.cn22-1284.2015.04.004

2014-11-21

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“長白山山野菜泡菜生產(chǎn)加工關(guān)鍵技術(shù)研究及生產(chǎn)應(yīng)用”(2013419008CB)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目“長白山山野菜泡菜生產(chǎn)加工關(guān)鍵技術(shù)研究”(吉教科合字[2013]第495號)；通化師范學(xué)院校級項(xiàng)目“長白山山野菜泡菜生產(chǎn)加工關(guān)鍵技術(shù)研究”(201270)

何文兵,吉林九臺人,在讀博士,副教授．

Q93

A

1008-7974(2015)02-0011-03