牦牛血紅細胞超聲破碎條件優(yōu)化

文 / 康克龍 何守貴 李曉鵬 文鵬程 趙保堂 張衛(wèi)兵

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州，730070；甘肅嘉泰信息科技有限公司，甘肅蘭州，730030）

牦牛血紅細胞超聲破碎條件優(yōu)化

文 / 康克龍 何守貴 李曉鵬 文鵬程 趙保堂 張衛(wèi)兵*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州，730070；甘肅嘉泰信息科技有限公司，甘肅蘭州，730030）

為了提高牦牛血紅細胞破碎率，采用單因素和正交試驗設計，以新鮮的牦牛血為原料，對影響血紅細胞破碎率的破碎功率、破碎時間、血細胞濃度、破碎時間間隔四個單因素進行了優(yōu)化。結(jié)果最佳超聲破碎條件表明：超聲破碎紅血細胞的最優(yōu)條件是破碎功率為200W、破碎時間為15min、血細胞濃度為5:1、時間間隔為6/9，破碎率達到65.23%。

牦牛；血細胞；破碎

血紅素是由一個二價鐵離子鑲嵌在一個原卟啉環(huán)而構(gòu)成的稱為鐵卟啉的化合物，主要存在于動物的血液和肌肉中，是動物血液中的天然色素，具有重要的生理功能和很高的實用價值，在醫(yī)藥、食品、化工、保健品等行業(yè)中有廣泛的應用。動物血液是提取血紅素的優(yōu)質(zhì)來源[1-3]。血紅素主要存在于血液的紅細胞內(nèi)，紅細胞經(jīng)過破碎才能提取到血紅素[7-9]。目前，常用的細胞破碎方法有高速勻漿法、酶溶法、化學滲透法等，但是大多存在處理時間長、易造成產(chǎn)物抑制、胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低、化學毒性較強等缺點[10-12]。超聲破碎操作簡單，液量損失少，采用此方法不但降低了生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期，而且還避免了使用對環(huán)境有污染的氯仿和吡啶等溶劑。

我國牦牛數(shù)量多，牦牛血資源豐富，并且牦牛血液中血紅蛋白(Hb)含量很高，從牦牛血液中提取血紅素，原料獨特豐富，成本較低，同時能夠產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益[4-6]。本試驗以新鮮牦牛血原料，研究超聲破碎功率、時間、細胞濃度和時間間隔等因素對破碎牦牛血紅細胞的影響，尋找最佳的牦牛血紅細胞破碎工藝參數(shù)，以提高紅細胞破碎率。

1 、材料與儀器

1.1 原料和試劑

原料：牦牛血，康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團公司提供。

試劑：冰醋酸、氯化鈉、丙酮、無水乙醇、氯仿、NaOH、HCl等。

1.2 試驗儀器

電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），高速臺式冷凍離心機（TGL-20MC，長沙平凡儀器儀表有限公司），小型高速粉碎器（XHF-D，寧波新芝生物科技股份有限公司），超聲波細胞粉碎機（Scient2-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司），生物顯微鏡（DYS-328，上海點應光學儀器有限公司），血球計數(shù)板，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠），循環(huán)水真空泵（SAI-III，上海亞榮生化儀器廠）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

新鮮牦牛血液→離心→稀釋→超聲破碎→檢測破碎率

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 細胞濃度對超聲破碎效果的影響

調(diào)整血細胞濃度為3:1、4:1、5:1、6:1、7:1，設定超聲波功率為200W，時間間隔為6/9，破碎15min，超聲破碎后測定破碎率，考察細胞濃度對超聲破碎效果的影響。

1.3.2.2 超聲破碎時間對超聲破碎效果的影響

將破碎儀的工作時間分別設定為5、10、15、20、25 min，調(diào)整血細胞濃度為5:1，設置功率為200W，時間間隔為6/9時，超聲破碎后測定破碎率，考察破碎時間對超聲破碎效果的影響。

1.3.2.3 超聲破碎功率對超聲破碎效果的影響

破碎儀功率分別設定為100W、150W、200W、250W、300W，調(diào)整血細胞濃度5:1，設置時間間隔為6/9，破碎15min，超聲破碎后測定破碎率，研究破碎功率對超聲破碎效果的影響。

1.3.2.4 超聲破碎時間間隔對超聲破碎效果的影響

將時間間隔設置為2/9、4/9、6/9、8/9，調(diào)整血細胞濃度為5:1，破碎功率設定為200W，破碎15min，超聲破碎后測定破碎率，研究時間間隔對超聲破碎效果的影響。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇破碎時間、破碎功率、血細胞濃度、時間間隔4個影響血細胞破碎率的因素進行正交試驗，研究上述因素的綜合效果。

1.3.4 破碎率的測定[13]

將超聲破碎前后的細胞懸液分別稀釋至適當倍數(shù)后，在顯微鏡下觀察，用血球計數(shù)板對完整形態(tài)細胞進行計數(shù)，計算細胞破碎率，每組統(tǒng)計3次取平均值。

式中：A1為破碎前的細胞計數(shù)結(jié)果；A2為破碎后的細胞計數(shù)結(jié)果。

2 、結(jié)果分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 血細胞濃度對血細胞破碎率的影響

圖1 不同血細胞濃度對細胞破碎率的影響

細胞濃度影響著懸浮液的流變特性，從而會影響細胞破碎率。由圖1可以看紅細胞濃度較高或較低都不利于細胞破碎。當V水:V血細胞為3:1時，細胞的破碎率為46.67%。隨著水添加量的增加細胞破碎率逐漸升高，當V水:V血細胞為5:1時，細胞破碎率達到最大，為60.67%。而后隨著水添加量的繼續(xù)增加，細胞破碎率反而開始緩慢下降。當V水:V血細胞為7:1時，細胞破碎率為55%。因此，選擇紅細胞的最佳濃度是V水:V血細胞為5:1。這是因為細胞濃度直接影響溶液的度，從而影響超聲波在液體中的空化效應。溶液稠度越大，不利于空化泡的形成及其膨脹的作用，影響破碎效果[14]。

2.1.2 超聲破碎時間對血細胞破碎率的影響

圖2 不同超聲破碎時間對血細胞破碎率的影響

破碎時間也是影響細胞破碎率重要因素之一。由圖2可以看出，當細胞破碎時間為5min時，細胞破碎率只有34%。隨著時間的延長，細胞破碎率迅速增加，當破碎時間為15min時，細胞破碎率達到了46.33%。而后隨著時間的繼續(xù)延長，破碎率開始緩慢增加，當破碎時間為25min時，細胞破碎率為48.86%。主要原因是超聲破碎時間過短，不能有效地破壞紅細胞細胞壁，破碎時間長，會使破碎過程中產(chǎn)生更多的熱，使得溶液液出現(xiàn)泡沫，并且由于時間過長細胞過于破碎，導致大量蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)被提取出來，增加后續(xù)提取分離的難度[15]。因此，選擇15min為最佳細胞破碎時間。

2.1.3 超聲破碎功率對血細胞破碎率的影響

超聲破碎輸出功率反映了超聲波能量的大小，也是影響細胞破碎率的重要因素。超聲破碎功率過小會造成細胞破碎率低，破碎不完全，輸出功率的增大有利于液體中空穴的形成，但是輸出功率過大，由于超聲波處理空化作用引起的細胞液局部的高溫高壓，會引起樣品飛濺或產(chǎn)生泡沫[16]。由圖3可以看出，超聲破碎功率對細胞破碎率有很大的影響, 輸出功率的增大有利于液體中空穴的形成,產(chǎn)生更多的空化泡，使破碎作用增強。當破碎功率由100W升高到200W時，細胞破碎由31.33%迅速的增加到了46%。但當功率提高至200W以后時，破碎率增加趨勢很小，因此將200W確定為最佳破碎功率。

圖3 不同超聲破碎功率對血細胞破碎率的影響

2.1.4 超聲破碎時間間隔對血細胞破碎率的影響

圖4 不同超聲破碎時間間隔對血細胞破碎率的影響

工作時間／間歇時間是超聲破碎過程中的重要因素之一，其直接影響細胞破碎率，而且不同時間間隔還會引起超聲破碎過程中熱效應和空化效應的改變[16]。由圖4可以看出，當超聲時間為2s時，細胞破碎率為36.67%。之后隨著工作時間的增加細胞破碎率迅速增加，當工作時間為6s時，細胞破碎率增加到了57%。再隨著工作時間增加到8s時，細胞破碎率反而下降為54.67%。原因是采用短時多次超聲波輻射的工作方式有利于細胞破碎，而延長每次超聲波輻射時間、減少輻射次數(shù)的工作方式使破碎率明顯降低。超聲波通過空化效應破碎細胞的過程實際就是空化泡形成、振動、膨脹、壓縮和崩潰閉合的過程，這一過程需要一段短暫的時間來完成，短時多次的工作方式能使超聲波產(chǎn)生的空化泡，有足夠的時間和更多機會完成膨脹和爆炸過程, 因此有利于細胞的破碎[17]。因此，選擇工作時間／間歇時間為6/9是最佳條件破碎時間間隔。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇血細胞濃度、超聲破碎時間、功率和時間間隔4個影響血細胞破碎率的因素進行正交試驗。正交試驗因素水平表見表1，正交實驗結(jié)果見表2。

表1L9( 34)正交試驗因素水平表Table1Orthogonal layout of factors and number of level L9( 34)

表2正交實驗結(jié)果Table2The result analyses of orthogonal experiment

從極差分析可知，破碎時間（A）、破碎功率（B）、血細胞濃度（C）、時間間隔（D）四因素對血細胞破碎率的影響大小為A>D>C>B，最佳超聲波破碎血細胞的組合為A2B3C1D3，即破碎時間為15min、破碎功率為200W、血細胞5:1、時間間隔6/9為血細胞破碎的最佳條件，即破碎率達到65.23%。

選取最佳組合A2B3C1D3進行驗證試驗，3次重復試驗的平均破碎率為66.12%，與正交試驗的破碎率差異不顯著。

3 、結(jié)論

本試驗通過血細胞濃度、破碎功率、破碎時間、時間間隔四個單因素試驗和正交試驗及其驗證試驗確定出最佳細胞破碎條件為:血細胞濃度5:1、破碎功率200W、破碎時間15min、時間間隔6/9，破碎率達到65.23%。

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蘭州市科技計劃項目(2014-2-29) ；甘肅農(nóng)業(yè)大學SRTP項目(20141030)