腓骨肌萎縮癥1型患者肌電圖及PMP22基因特點分析

潘曉麗 潘志宏 張楠楠 高紅

腓骨肌萎縮癥1型患者肌電圖及PMP22基因特點分析

潘曉麗 潘志宏 張楠楠 高紅

目的 探討和研究腓骨肌萎縮癥1型(Charcot-Marie-Tooth disease 1，CMT1)患者肌電圖和PMP22基因改變特點。方法 對43例CMT1患者進行常規(guī)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和肌電圖檢查，應(yīng)用PCR雙酶切方法對其中33例CMT1患者及15名健康志愿者(對照組)檢測17p11.2-12PMP22基因重復(fù)序列(即1760 bp片段)。33例CMT1患者依有無17p11.2-12PMP22基因特異性片段分為PMP22基因特異性片段陽性組與陰性組，比較兩組患者神經(jīng)傳導(dǎo)改變有無差異。結(jié)果 43例患者均行肌電圖檢測，均表現(xiàn)為運動或感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度存在明顯減慢(100%)，感覺神經(jīng)病變重于運動神經(jīng)，下肢受累程度重于上肢；所檢129塊肌肉中，88塊(68.2%)呈神經(jīng)源性損害。經(jīng)PMP22基因?qū)W檢測的33例中20例(60.6%)檢測出1760 bp片斷，對照組均未檢測到此片段。PMP22基因特異性片段陽性組感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度、運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度及遠端潛伏期與陰性組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 CMT1患者肌電圖改變具有其特異性，結(jié)合PCR-雙酶切法檢測PMP22特異性基因重復(fù)序列可提高診斷CMT1的準確性及敏感性。

腓骨肌萎縮癥；PCR-雙酶切；PMP22基因；肌電圖

腓骨肌萎縮癥(Charcot-marie-tooth disease，CMT)是一組最常見的具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的周圍神經(jīng)單基因遺傳病，其發(fā)病率為4/10 000[1]。目前認為本病是一個綜合征而不是獨立性疾病，已將其歸類在遺傳性運動和感覺性神經(jīng)病的范疇。CMT呈慢性進行性病程，致殘率高，其病理變化主要發(fā)生于周圍神經(jīng)的遠端部分、前根及后根，表現(xiàn)為對稱性、節(jié)段性脫髓鞘改變及軸突變性。臨床根據(jù)CMT的病理和電生理特點分為脫髓鞘型(CMT1)和軸突型(CMT2)，其中CMT1約占70%。分子遺傳學(xué)研究至少已發(fā)現(xiàn)40個致病基因位點，其中27個已被克隆[2-3]。本研究對43例CMT1患者肌電圖和PMP22基因檢測結(jié)果進行分析，期望對臨床深入了解CMT有所幫助。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 2003-03-2013-03中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院就診的CMT1患者43例，分別來自兒內(nèi)科、兒骨科、發(fā)育兒科及神經(jīng)內(nèi)科門診，共37個家系。其中男28例，女15例。發(fā)病年齡為4～19歲，中位數(shù)8.5歲(QL=3.5歲，QU=11.6歲)，檢測時病程為0.67～10年，中位數(shù)4.5年(QL=3.0年，QU=8.5年，)。無癥狀親屬(父母、祖父母、外祖父母等)52名。健康對照15名，男7名、女8名，年齡8～40歲，中位數(shù)13歲(QL=10歲，QU=32歲)，均為除外周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)根性病變等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的健康志愿者。CMT診斷參考Dyck1993的標準[4]：(1)有慢性進行性雙下肢遠端無力及肌萎縮，可伴有雙上肢受累；(2)查體有周圍神經(jīng)損害表現(xiàn)，跟腱反射消失，下肢感覺障礙；(3)肌電圖示運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減低，正中神經(jīng)傳導(dǎo)速度<38 m/s；(4)排除吉蘭-巴雷綜合征及其他因素導(dǎo)致的周圍神經(jīng)病；(5)有明確CMT家族史支持診斷；(6)神經(jīng)活檢示有髓纖維數(shù)量減少，有髓鞘脫失，Schwann細胞節(jié)段性再生，繞軸突形成同心圓樣的“洋蔥球”結(jié)構(gòu)，可以確診。符合上述1～4條患者即可入選。本研究經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，受試者本人或監(jiān)護人知情并同意。

1.2 方法

1.2.2 PCR法檢測PMP22基因：取外周血5 mL，2%(質(zhì)量濃度)EDTA抗凝，常規(guī)提取DNA，DNA溶于10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/LEDTA溶液中(pH 7.5)保存。引物由invitrogen英駿生物技術(shù)有限公司合成。PMP22(peripheral myelin protein，PMP22)引物：遠端為5′-GCTCAATTTTGGTGTTTAAATCAG-3′，近端為5′-ACTCTCTAGTTACCCCTTTATTT-3′。反應(yīng)體系中DNA 5 μL，dd.H2O 292.6 μL，10X緩沖液55 μL，dNTPs 44 μL(2.5 mmol/L)，TaqDNA多聚酶4.4 μL(5 U/μL)，Pmp22-F 及Pmp22-P各2.2 μL。94℃預(yù)變性3 min后，進入循環(huán)。循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 30 s，50℃ 60 s，72℃ 2 min，33個循環(huán)后72℃延伸10 min。取產(chǎn)物5 μL+EcoRⅠ(or NsiⅠ)12 U+緩沖液2 μL，37 ℃水浴酶切過夜，0.8%(體積分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，存入10 Kodak成像分析系統(tǒng)。參照Marker相對分子質(zhì)量標準，1760 bp條帶為特異性酶切片段，有此片段診斷為基因重復(fù)。

將進行PMP22基因檢測的患者按有無特異性片段分為PMP22基因特異性片段陽性組及陰性組兩組，對兩組患者感覺神經(jīng)及運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度進行比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行分析。神經(jīng)傳導(dǎo)速度用均數(shù)±標準差表示。PMP22基因特異性片段陰性組及陽性組患者感覺神經(jīng)及運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點 本組患者28例(65.2%)為散發(fā)病例；15例(34.8%)有家族史，來自9個家系，其中有3例患者的家系1個，有2例患者的家系4個(其中2個家系有兩例患者由于年齡較大，行動不便沒有參加本研究)，有1例患者的家系4個(其中1個家系的1例患者由于行動不便沒有參加本研究)?；颊呔鶠槁云鸩?，表現(xiàn)為進行性雙下肢或四肢對稱性遠端無力和肌萎縮，進展緩慢。癥狀局限于雙下肢者29例(67.4%)，呈跨閾步態(tài)，患者均有不同程度弓形足，其中10例曾被誤診為馬蹄內(nèi)翻足進行過矯形手術(shù)。前臂或手肌萎縮13例(30.2%)?！苞Q樣腿”13例(30.2%)均為病程大于5年的患者。腱反射減弱或消失29例(67.4%)，深淺感覺減退20例(46.5%)。所有患者均無錐體束征，血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌紅蛋白等均在正常范圍。

2.2 神經(jīng)傳導(dǎo)速度 結(jié)果見表1。43例患者均被檢測到運動或感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度存在明顯減慢，感覺神經(jīng)病變重于運動神經(jīng)，下肢受累程度重于上肢。即使是癥狀局限在下肢的患兒，上肢神經(jīng)傳導(dǎo)也均出現(xiàn)了明顯的異常改變，總異常率100%?；颊叻謩e表現(xiàn)為不同神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯減慢，其中感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度均低于正常下限的80%，運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度均低于正常下限的75%。上、下肢運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度均<38 m/s，遠端潛伏期明顯延長，均高于正常上限的150%，波幅降低。

2.3 肌電圖 共檢測43例患者129塊肌肉，88塊呈神經(jīng)源性損害(68.2%)，其中76塊為遠端肌肉，12塊為近端肌肉；18塊可疑神經(jīng)源性損害(13.9%)，其余23塊正常(17.8%)。43例中37例(86.1%)存在神經(jīng)源性損害，遠端肌肉均呈神經(jīng)源性損害，近端肌肉呈神經(jīng)源性損害者12例。

2.4PMP22基因特異性片段檢測 43例患者中有33例(包括來自8個有家族史的家系的患者13例)進行了PMP22基因?qū)W檢測。20例(60.6%)檢測出1760 bp片段，其中有6例父親、9例母親檢測出同樣的異常。對照組未檢測到此片段(圖1)。

表1 43例CMT1患者神經(jīng)傳導(dǎo)檢測結(jié)果 〔n=43，n(%)〕

注：NCV：神經(jīng)傳導(dǎo)速度；Lat：遠端潛伏期；Amp：復(fù)合肌肉動作電位波幅

1、5、6、7為基因重復(fù)的患者；C為健康人(陰性對照)；2、3為未檢出重復(fù)的患者；M為DNA Marker DL2000

圖1 CMT1患者及對照組PCR-雙酶切分析結(jié)果

2.5 有、無PMP22基因特異性片段患者神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較 結(jié)果見表2。兩組患者不同感覺神經(jīng)、不同運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降程度及遠端潛伏期延長程度等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 PMP22基因特異性片段陽性組與陰性組神經(jīng)傳導(dǎo)速度異常比較±s，%)

注：SCV：感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度； MCV：運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度；Lat：遠端潛伏期

3 討論

目前的研究認為，CMT1為常染色體顯性遺傳，一般在10～20歲時發(fā)病, 起病隱襲, 國內(nèi)報道的平均發(fā)病年齡為20～26歲[5], 本組病例發(fā)病年齡最早為4歲，中位數(shù)8.5歲，明顯低于此前報道，可能與本研究大部分病例來源于兒科有關(guān)，所選患者本身年齡偏小，樣本數(shù)量有限，因此尚需進一步研究。43例患者中只有15例有家族史，28例為散發(fā)病例。所有患者均符合CMT1的臨床特征，臨床上不難診斷。但是本研究中有10例CMT1患者，由于發(fā)病年齡較小并出現(xiàn)足部內(nèi)翻畸形而誤診為馬蹄內(nèi)翻足進行過矯形手術(shù)，因病因未除，術(shù)后效果不佳。因此建議臨床對馬蹄內(nèi)翻足患兒應(yīng)常規(guī)進行術(shù)前肌電圖檢查，既可評價神經(jīng)肌肉功能，亦可除外CMT1。CMT1患兒的肌電圖改變具有明顯特征，而且其不僅局限在下肢，上肢也會有明顯異常，尤其是正中神經(jīng)的運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度均<38 m/s。

CMT1進展緩慢，肌電圖可以顯示慢性去神經(jīng)支配和神經(jīng)再生現(xiàn)象，表現(xiàn)為纖顫電位、正銳波和束顫電位，以及長時程、高波幅的運動單位電位并且募集相減少，神經(jīng)傳導(dǎo)速度表現(xiàn)為不同程度的減慢。本組患者所檢測的129塊肌肉中，88塊呈神經(jīng)源性損害(68.2%)。以遠端肌肉病變較為嚴重；周圍神經(jīng)感覺及運動神經(jīng)傳導(dǎo)均有明顯減慢，無論病程長短，運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度均<38 m/s。之所以出現(xiàn)傳導(dǎo)速度的減慢，主要是由于節(jié)段性的脫髓鞘，使得在有髓區(qū)域不能進行跳躍式的傳導(dǎo)，其次大纖維選擇性喪失，導(dǎo)致傳導(dǎo)最快的纖維速度減慢。一些患者雖然臨床癥狀局限于下肢，但上肢的神經(jīng)傳導(dǎo)異常已經(jīng)存在，這表明在臨床癥狀出現(xiàn)前已經(jīng)有周圍神經(jīng)的脫髓鞘改變。肌電圖是對神經(jīng)肌肉功能評價最有效的檢查手段，臨床上應(yīng)對那些起病緩慢、隱襲、臨床表現(xiàn)不典型，患者不能提供遺傳史的散發(fā)病例，進行四肢肌電圖和神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查，可有效地減少臨床的漏診和誤診，由于周圍神經(jīng)脫髓鞘的異常改變隨病情進展，可在神經(jīng)傳導(dǎo)等電生理指標上得到準確的體現(xiàn)，因此肌電圖檢查可以評價患者的疾病進展程度。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，PMP22基因特異性片段陽性組與陰性組神經(jīng)傳導(dǎo)速度異常特征性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示肌電圖在不同基因型CMT1患者的鑒別上無特殊價值。

目前研究發(fā)現(xiàn)70%以上相互無血緣關(guān)系的CMT1家系(獨立家系，每個家系內(nèi)有2例以上CMT1患者)及90%以上的散發(fā)患者多由17p11.2-12區(qū)(包含PMP22基因)的1.5 Mb的正向串聯(lián)重復(fù)突變所致，兩翼有長約30 kb的低拷貝重復(fù)序列稱REPs。目前已證實CMT1的交換熱點位于30 kb的CMT1A-REP上1.7 kb的區(qū)域，并且75%以上的CMT1患者交換斷裂點位于該區(qū)域；對斷裂點設(shè)計特定的引物進行擴增酶切獲得特異性酶切片段即可診斷為基因重復(fù)異常[6-7]。PMP22在周圍神經(jīng)中有高度表達，其表達受軸突調(diào)節(jié)，其功能可能為維持髓鞘結(jié)構(gòu)的完整性、調(diào)節(jié)細胞周期及作為黏附分子。PCR-雙酶切法的原理：大多數(shù)CMT患者的重組斷點位于遠端CMT1-REP特有的EcoR Ⅰ位點和近端REP特有的Nsi Ⅰ位點之間。為區(qū)分PCR擴增，引物的選擇分別為遠端和近端REP所特有的序列，位于1.7 kb熱點區(qū)的兩側(cè)。用EcoR Ⅰ和Nsi Ⅰ消化后可獲得特異性融合片段1760 bp。這樣來自CMT患者的標本且交換熱點位于1.7 kb區(qū)域者可以產(chǎn)生特異性融合片段，而來自對照組的標本或重組發(fā)生于熱點區(qū)外者，不應(yīng)有此片段。本研究共檢測33例患者，20例(60.6%)檢測出1760 bp片段。其中13例有家族史的患者中均檢測出此片段。健康對照組無檢測到此片段者，總檢出率低于文獻報道[8-9]。本組患者均為CMT1，肌電圖改變主要以周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢為主，但由于該病存在很大的遺傳異質(zhì)性，所以在遺傳學(xué)改變上不盡相同，尚需進一步對本組患者進行其他相關(guān)基因的研究。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Electromyography andPMP22 gene analysis in patients with type 1 Charcot-Marie-Tooth disease

PANXiaoli*,PANZhihong，ZHANGNannan,GAOHong.

*NeuroelectrophysiologyLab,DepartmentofNeurology,ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity,ShenyangLiaoning110004，China

PAN Xiaoli，Email: panxl@sj-hospital.org

Objective To study the electromyography andPMP22 gene features in patients with type 1 Charcot-Marie-Tooth(CMT)disease. Methods Routine electromyography and nerve conduction were performed in 43 patients with CMT 1. Polymerase chain reaction(PCR) combined with restriction enzyme digestion was used to detectPMP22 gene duplication on chromosome 17p11.2-12 (1760 bp)in 33 CMT 1 patients and 15 healthy volunteers (the control group). According to the presence or absence of 17 p11.2-12PMP22 gene segments, 33 CMT 1 patients were divided into the positive group and the negative group. Parameters of nerve conduction were compared between two groups. Results All of the patients had the nerve conduction velocities slower or disappeared (43/43,100%). Sensory nerves and motor nerves were probably damaged at the same time, but the damages of the sensory nerves were more severe than those of the motor nerves, the damages of the lower limbs were more severe than those of the upper. Of 129 muscles tested, 88 (68.2%) showed neurogenic damages. 60.6%(20/33)of the patients were identified to have specific junction fragments(1760 bp). Duplication was not identified in the controls. There were no statistically significant difference of the parameters, such as sensory nerve velocity, motor nerve conduction velocity and distal latency between two groups (P>0.05). Conclusions Electromyography has its specificity in CMT 1 patients, in combination with double enzyme digestion method by PCR to detectPMP22 repetitive sequence specific genes can increase the accuracy and sensitivity in the diagnosis of CMT 1.

Charcot-Marie-Tooth disease；PCR-double enzyme digestion；PMP22 gene；electromyography

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.02.002

110004中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)功能室(潘曉麗、張楠楠)；110013沈陽市紅十字會醫(yī)院骨科(潘志宏)；110004中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 先天畸形實驗室(高紅)

潘曉麗，Email：panxl@sj-hospital.org

R746.4

A

1006-2963 (2015)02-0082-04

2014-01-09)