HPLC法測定黃牡丹不同部位中沒食子酸和丹皮酚的含量*

王琳，周濃，代亨英

(大理學(xué)院藥學(xué)院，大理 671000)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

HPLC法測定黃牡丹不同部位中沒食子酸和丹皮酚的含量*

王琳，周濃，代亨英

(大理學(xué)院藥學(xué)院，大理 671000)

目的 建立黃牡丹中活性成分沒食子酸和丹皮酚的含量測定方法，并考察黃牡丹不同部位中沒食子酸和丹皮酚的含量差異。方法 采用高效液相色譜(HPLC)法，Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0 min→25 min→45 min，乙腈0%→24%→36%，流速為0.8 mL·min-1；檢測波長為274 nm；柱溫為30 ℃。結(jié)果 沒食子酸、丹皮酚線性范圍分別為0.10～2.00 μg(r=0.999 8，n=6)、0.005 2～0.104 0 μg(r=1.000 0，n=6)，平均回收率(n=9)分別為102.16%(RSD=2.51%)、97.61%(RSD=1.34%)。沒食子酸在不同部位的含量分布為果實>葉>皮部> 栓皮>木部>莖；丹皮酚在不同部位的含量分布為栓皮>皮部>木部>莖，果實、葉中未檢出。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡捷，為黃牡丹藥材提供更合理、可靠的質(zhì)量控制方法。

黃牡丹；沒食子酸；丹皮酚；色譜法，高效液相

黃牡丹為毛茛科植物黃牡丹[PaeoniadelavayiFranch.var.lutea(Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep.]，其干燥根和根皮在云南省常作為中藥赤芍和赤丹皮使用，具有清熱涼血、活血化瘀等功效[1]。黃牡丹特產(chǎn)于我國云南、四川西南部及西藏東南部，是國家三級重點(diǎn)保護(hù)的珍稀植物[2]。黃牡丹的根皮、根、花等均有入藥使用的習(xí)慣[1-4]。黃牡丹含芍藥苷、丹皮酚、沒食子酸、揮發(fā)油及植物甾醇等多種化學(xué)成分[4-5]，其主要有效成分丹皮酚具有抗心律失常、抗缺血-再灌注性損傷、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、抗菌、鎮(zhèn)痛等作用[6]；沒食子酸具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗肝損傷、抗病毒等作用[7]。國內(nèi)外有關(guān)黃牡丹的研究較少且不系統(tǒng)，僅對其系統(tǒng)分類、染色體、孢粉學(xué)、種子萌發(fā)、栽培與育種等方面有少量文獻(xiàn)報道[8-9]。目前尚無特有指標(biāo)成分的含量測定方法控制黃牡丹藥材質(zhì)量，而且各個部位有效成分的含量高低尚不明確。因此，本實驗擬采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法對黃牡丹各部位中丹皮酚、沒食子酸的含量測定及分析，以期為黃牡丹的內(nèi)在質(zhì)量評價及其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100 LC型高效液相色譜儀(美國 Agilent 公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；AE240電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 試藥 丹皮酚、沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110708-200506，110831-200803，供含量測定用)；乙腈(色譜純，德國默克試劑公司)，水為娃哈哈牌純凈水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。黃牡丹樣品于2010年6月采集于云南省大理市花甸壩，并經(jīng)大理學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室周濃副教授鑒定為毛茛科植物黃牡丹(Paeoniadelavayivar.lutea)的全株。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0 min→25 min→45 min，乙腈0%→24%→36%；檢測波長：274 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。對照品和黃牡丹樣品(1號樣品)分離的色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品、丹皮酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含沒食子酸100.00 μg、丹皮酚5.20 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粗粉約0.20 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加純化水40 mL，回流提取1 h后，取出，放冷，過濾，將濾液加純化水并定容至50 mL量瓶中，搖勻，取上清液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，得進(jìn)樣量C(μg)與峰面積(A)的線性方程。結(jié)果表明，沒食子酸和丹皮酚進(jìn)樣量分別在0.10～2.00，0.005 2～0.104 0 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為：A=4 256.6C+3.008，r=0.999 8(n=6)；A=9 687.6C+2.847 9，r=1.000 0(n=6)。

2.4 精密度實驗 以混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算沒食子酸、丹皮酚的RSD分別為0.29%，0.69%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實驗 取同一份樣品(1號樣品的皮部)粉末6份，按“2.2.2”項供試品溶液的制備方法制備及“2.1”項色譜條件測定，測得沒食子酸、丹皮酚的平均含量分別為10.124 8 ，0.563 2 mg·g-1，RSD分別為1.91%，2.31%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液(1號樣品的皮部)，室溫密閉放置，分別在制備后0，5，10，15，20，25 h進(jìn)樣，測定沒食子酸、丹皮酚峰面積，RSD分別為0.24%，0.99%(n=6)，表明樣品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的黃牡丹藥材(1號樣品的皮部)約0.10 g，共9份，分別精密加入一定量的沒食子酸、丹皮酚對照品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備及“2.1”項色譜條件測定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，沒食子酸、丹皮酚平均回收率分別為102.16%，97.61%，RSD分別為2.51%，1.34%，符合分析要求。

A.對照品；B.栓皮；C.皮部；D.木部；E.莖；F.葉；G.果實；1.沒食子酸；2.丹皮酚

A.reference substance；B.cork periderm；C.cortex and phloem；D.xylem and pith；E.stem；F.leave；G.fruit；1.gallic acid；2.paeonol

Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and samples

表1 沒食子酸和丹皮酚加樣回收實驗結(jié)果

Tab.1 Result of recovery experiment of gallic acid and paeonol

測定成分稱樣量/g原有量加入量測得量mg回收率/%沒食子酸0．10061．01860．80001．8475103．610．10111．02360．80001．8658105．280．10011．01350．80001．8639106．300．10241．03681．00002．0634102．660．10131．02561．00002．0407101．510．10201．03271．00002．031699．890．10201．03271．20002．216998．680．10031．01551．20002．2336101．510．10151．02771．20002．227399．97丹皮酚0．10060．05670．04800．104699．790．10110．05690．04800．103897．710．10010．05640．04800．103698．330．10240．05770．06000．115496．170．10130．05710．06000．116298．500．10200．05740．06000．114795．500．10200．05740．07200．127397．080．10030．05650．07200．127398．330．10150．05720．07200．127197．08

2.8 樣品含量測定 分別按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，平行3份，按“2.1”項下色譜條件測定，以峰面積分別代入回歸方程中計算沒食子酸、丹皮酚的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

供試品溶液制備方法的選擇：實驗中分別考察了超聲提取、加熱回流、索氏提取等方法的提取效果，其中，回流提取法的提取效率最高[10-12]。而回流提取法中，又分別比較不同的溶劑(重蒸水、甲醇、乙醇)、不同提取時間等提取效果，實驗表明以重蒸水為提取溶劑，提取1 h可將黃牡丹中的沒食子酸、丹皮酚基本提取完全。

流動相的選擇：在流動相系統(tǒng)的選擇中，實驗比較甲醇-水、乙腈-水等流動相系統(tǒng)[11-13]，從分離情況和出峰時間等綜合分析選擇乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫為佳，峰形對稱且分離度較好，保留值適宜，柱后處理簡便、省時。

檢測波長的選擇：用二極管陣列檢測器在本實驗溶劑體系條件下，分析沒食子酸、丹皮酚對照品色譜峰和12個樣品中目標(biāo)組分相應(yīng)色譜峰的紫外光譜，結(jié)果保留值相同處紫外光譜基本一致，沒食子酸、丹皮酚兩成分在274 nm處有最大吸收[10，13-14]。待測組分與相鄰峰基本能基線分離，檢測靈敏度高，因此，確定沒食子酸、丹皮酚檢測波長為274 nm。

本研究以沒食子酸、丹皮酚為考察指標(biāo)，對不同部位黃牡丹中沒食子酸、丹皮酚含量的比較，沒食子酸在各部位的平均含量分布狀態(tài)為果實>葉>皮部> 栓皮>木部>莖，丹皮酚在各部位的平均含量分布狀態(tài)為栓皮>皮部>木部>莖，果實、葉中未檢出。而黃牡丹地上部分(葉、果實)的沒食子酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)入藥部位的根，提示這些部位均可作為提取物的制備原料。黃牡丹不同部位在功用方面的差別，除受沒食子酸含量的影響外，還與其他活性成分有關(guān)，值得深入研究。

黃牡丹的根皮為1996年版《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》收載的滇產(chǎn)赤丹皮[1]，但丹皮酚的含量遠(yuǎn)低于正品牡丹皮的含量限度(≥12 mg·g-1)[15]，所得的結(jié)論與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，這些滇產(chǎn)赤丹皮品種是否能作為“正品”牡丹皮使用，需結(jié)合藥理、藥效和臨床應(yīng)用來對其進(jìn)一步的研究。

本實驗采用HPLC法測定黃牡丹中沒食子酸、丹皮酚的含量，具有用量少、方法快速、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為黃牡丹的深入研究與開發(fā)提供參考，也為黃牡丹的質(zhì)量控制研究提供理論依據(jù)。

表2 黃牡丹不同部位中沒食子酸和丹皮酚的含量

不同部位沒食子酸含量比較，F(xiàn)=131.447，P<0.01；不同部位丹皮酚含量比較，F(xiàn)=2 193，P<0.01；“…”表示未檢出；與栓皮比較，*1P<0.01

Comparion of gallic acid among different parts，F(xiàn)=131.447，P<0.01；Comparion of paeonol among different parts，F(xiàn)=2 193，P<0.01；“…” means “undetected”;Compared with cork and periderm，*1P<0.01

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Determination of Gallic Acid and Paeonol in Different Medicinal Parts ofPaeoniadelavayivar.lutea by HPLC

WANG Lin, ZHOU Nong, DAI Hengying

(CollegeofPharmacy,DaliUniversity,Dali671000,China)

Objective To establish a method to assay the content and distribution of two active ingredients, gallic acid and paeonol inPaeoniadelavayivar.lutea. Methods HPLC was adopted.The chromatograph column was Agilent TC-C18 spin column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid, and gradient elution was used.Elution condition was 0 min→25 min→45 min, the content of acetonitrile was 0%→24%→36%, the flow rate was 0.8 mL·min-1, detection wavelength was 274 nm, and column temperature was 30 ℃. Results The linear range of gallic acid and paeonol was 0.10-2.00 μg (r=0.999 8,n=6) and 0.005 2-0.104 0 μg (r=1.000 0,n=6), the average recovery was 102.16% (RSD=2.51%) and 97.61% (RSD=1.34%), respectively.The content order of gallic acid in different parts was fruit>leaf>epidermis> phelloderm>wood>stem.The content order of paeonol in different parts was phellodem>epidermis>wood>stem, but paeonol was not detected in fruits and leaves. Conclusion This method is accurate and simple, and can serve as a more reasonable and reliable quality control method for extraction ofPaeoniadelavayivar.lutea.

Paeoniadelavayivar.lutea; Gallic acid; Paeonol; Chromatography, high performance liquid

2014-01-11

2014-02-13

*國家自然科學(xué)基金資助項目(81260622)

王琳(1977-)，女，回族，云南大理人，講師，主要從事藥物化學(xué)研究。電話：0872-2257420，E-mail：wanglin1025wdx@163.com。

R282.71；R927.2

B

1004-0781(2015)02-0228-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.024