鵝脾混合多肽對小鼠非特異性免疫功能的影響*

田強，馮香芝，楊麗敏，趙鵬偉，姚星宇

鵝脾混合多肽對小鼠非特異性免疫功能的影響*

田強1，馮香芝2，楊麗敏3，趙鵬偉3，姚星宇2

(內(nèi)蒙古自治區(qū)滿洲里南區(qū)醫(yī)院1.檢驗科；2.內(nèi)科，滿洲里 021400；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室，呼和浩特 010059)

目的 檢測從鵝脾臟提取出的相對分子質(zhì)量<10 000混合多肽的含量及成分，并觀察該混合多肽對小鼠體內(nèi)淋巴細胞轉(zhuǎn)化及腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響。方法 采用冷凍離心透析法從鵝脾臟提取相對分子質(zhì)量<10 000的混合多肽，紫外分光光度計檢測多肽含量，氨基酸檢測儀和原子吸收儀進行多肽成分鑒定；將上述鵝脾混合多肽分別以大、中、小劑量對昆明種小鼠進行肌內(nèi)注射，并與空白對照組比較，連續(xù)給藥14 d，觀察小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化和巨噬細胞吞噬功能。結(jié)果 獲得的鵝脾混合多肽提取物pH=6.1，小分子多肽含量為23.78 μg·mL-1，成分鑒定結(jié)果顯示該混合物中含有10余種氨基酸及6種微量元素?；旌隙嚯?個劑量組淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及巨噬細胞吞噬率均顯著提高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。毒性實驗的半數(shù)致死濃度(LD50)>4 g·kg-1。結(jié)論 鵝脾混合多肽對小鼠免疫功能有明顯的調(diào)節(jié)和增強作用。

鵝脾多肽；淋巴細胞；巨噬細胞；吞噬功能

研究表明，多種疾病的發(fā)生與機體免疫功能的調(diào)節(jié)有著密切關(guān)系。很多藥物可以改善機體免疫抑制狀態(tài)[1]。脾臟作為機體最大的外周免疫器官，與機體細胞免疫及體液免疫關(guān)系密切，是發(fā)生免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答的主要場所[2-3]。筆者在本課題中利用內(nèi)蒙古滿洲里地區(qū)豐富的鵝廢棄脾臟為研究原料，從中提取、純化鵝脾多肽，確定多肽的成分，進行含量測定；并進行免疫藥效學(xué)實驗研究，探討鵝脾多肽調(diào)節(jié)免疫功能的生物活性，以期為鵝脾多肽輔助治療腫瘤、免疫缺陷和自身免疫性疾病奠定理論及實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠240只，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購自內(nèi)蒙古大學(xué)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蒙)2005-0003。飼養(yǎng)于普通潔凈環(huán)境，溫度22～23 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 試藥 無鈣鎂的Hank's(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20120322)、阿氏液(天津百浩生物科技有限公司，批號：20121109)、吉姆薩染色液(上海士鋒生物科技有限公司)、相對分子質(zhì)量10 000的透析膜(USA-GE)、牛肉湯培養(yǎng)液(上海江萊生物科技有限公司)、可溶性淀粉/植物血凝素(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)、氨基酸標準液(日本日立公司，批號：20120126)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、鹽酸醋酸鈉、醋酸、丙二醇、檸檬酸二鈉等均購自天津化學(xué)試劑廠。

1.3 儀器 AUY120 電子分析天平(日本島津公司)，L-8900氨基酸自動分析儀(日立)；RJ-TGL-16B臺式高速離心機(常州諾基儀器有限公司)；Leica-DM4000B顯微鏡(Olympus)；TOMY-SX-700高壓滅菌鍋(上?？茖W(xué)儀器有限公司)；210VGP型原子吸收光譜儀(美國BUCK公司)。

1.4 鵝脾混合多肽的提取及成分鑒定

1.4.1 鵝脾多肽的提取 把解凍的新鮮鵝脾臟用純化水清洗干凈，絞碎，用組織勻漿機破碎組織，收集勻漿，反復(fù)凍融3～5次。將脾臟勻漿1 kg加入0.9%氯化鈉溶液1 000 mL，用冷凍離心機4 ℃，5 000 r·min-1(有效離心半徑25 cm)離心30 min。取上清液裝入相對分子質(zhì)量為10 000的透析膜內(nèi)，在4 ℃生化培養(yǎng)箱中透析24 h，收集透析膜外的透析液。該透析液即為本實驗的終產(chǎn)物鵝脾混合多肽，經(jīng)冷凍干燥后，即得多肽干粉。

1.4.2 鵝脾混合多肽中的成分鑒定

1.4.2.1 鵝脾混合多肽中的氨基酸成分鑒定 按照氨基酸分析儀設(shè)定的洗脫程序，用不同離子強度、pH的緩沖液依次將氨基酸按吸附力的不同洗脫(依次為酸性氨基酸、中性氨基酸、堿性氨基酸)，被洗脫下來的氨基酸與茚三酮反應(yīng)液在加熱的條件下反應(yīng)(135 ℃)，生成可用紫外檢測器在波長570，440 nm檢測到的藍紫色物質(zhì)(仲氨生成淺黃色物質(zhì)檢測波長440 nm)外標法檢測[4]。

1.4.2.2 鵝脾混合多肽中礦物元素的鑒定 采用原子吸收光譜法[5]對鵝脾多肽物混合物中礦物元素鋅、鈣、鎂、銅、鐵、鉀含量進行測定。

1.5 1%雞紅細胞懸液的制備 無菌操作從雞心臟采血，將血液加入到1：5倍阿氏液中，搖勻，4 ℃貯存。用時吸取紅細胞懸液，1 500 r·min-1離心 5 min，棄去含有阿氏液的上清液；并加入5倍量滅菌PBS緩沖液pH7.0、 1 500 r·min-1離心5 min，洗滌2次，棄去上清液，然后用pH7.0的PBS緩沖液配制成濃度為1%壓積紅細胞懸液備用[6]。

1.6 淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 取昆明種小鼠80只，雌雄各半，按隨機數(shù)字表法將全部實驗小鼠隨機分為空白對照組，鵝脾混合多肽小劑量組、中劑量組和大劑量組，每組小鼠20只。鵝脾混合多肽小劑量組、中劑量組和大劑量組每天臀大肌肌內(nèi)注射給藥1次，0.2 mL(因本實驗藥物為多肽混合物，為避免口服給藥后造成藥物被胃蛋白酶消化而影響實驗結(jié)果)，分別給予鵝脾混合多肽1，10，100 mg·kg-1·d-1?？瞻讓φ战M給予0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)給藥16 d后，每只小鼠肌內(nèi)注射植物血凝素0.4 mg·d-1，連續(xù)2 d；各組小鼠均自由進食；實驗第18天分別取各組小鼠尾靜脈取血，制備T淋巴細胞染色涂片，用瑞氏染色油鏡下觀察淋巴細胞200個，計算淋巴細胞轉(zhuǎn)化率(%)[7]。

1.7 巨噬細胞吞噬實驗 小鼠80只，按“1.6”項方法分組和給藥。實驗第16天，肌內(nèi)注射后每只小鼠腹腔注射6%淀粉肉湯0.5 mL，24 h后腹腔注射1%雞紅細胞懸液1 mL，40 min后處死，并向腹腔注入無Ca2+、Mg2+的Hank's液3 mL，按摩腹腔1 min，吸取腹腔液于小試管內(nèi)500 r·min-1離心5 min，取上清液涂片、晾干[7]，瑞氏染色后，油鏡觀察，計數(shù)巨噬細胞100個，計算巨噬細胞吞噬百分率。巨噬細胞吞噬率(%)=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/100個巨噬細胞×100%[6，8]。

1.8 急性毒性實驗 昆明種小鼠80只，雌雄各半，按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、鵝脾混合多肽小劑量組、中劑量組和大劑量組，分別直接取鵝脾混合多肽2.0，3.0，4.0 g·kg-1經(jīng)小鼠雙側(cè)后腿外側(cè)肌內(nèi)注射，每側(cè)注射一半劑量，單次給藥。給藥容量25 mL·kg-1；空白對照組給予0.9%氯化鈉溶液。14 d內(nèi)觀察死亡情況，計算半數(shù)致死量(LD50)值[6]。

2 結(jié)果

2.1 鵝脾混合多肽的含量及成分檢測 經(jīng)冷凍離心透析法獲得的鵝脾混合多肽提取物為澄清透明、微黃色，pH酸度計檢測混合多肽pH 6.1，相對分子質(zhì)量為10 000，經(jīng)紫外分光光度計檢測小分子多肽含量為23.78 μg·mL-1；該混合物中含有10余種氨基酸，即甘氨酸、酪氨酸、組氨酸、丙氨酸、胱氨酸、天門冬氨酸、脯氨酸、絲氨酸、精氨酸等。原子吸收儀檢測到6種礦物元素，即鋅、鈣、鎂、銅、鐵、鉀。

2.2 鵝脾混合多肽對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 鵝脾混合多肽小劑量、中劑量和大劑量組與空白對照組在小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及腹腔巨噬細胞吞噬功能的比較上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 4組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及腹腔巨噬細胞吞噬功能比較

Fig.1 Comparison of lymphocytes transformation rate and phagocytic function of peritoneal macrophages among four groups of mice

2.3 急性毒性實驗結(jié)果 在觀察期間內(nèi)各組小鼠生長情況良好，未見消瘦、豎毛、呼吸急促、精神萎靡等中毒癥狀，也無死亡。實驗結(jié)束處死動物，大體解剖觀察未見異常。故小鼠最大耐受量(MTD)>4 g·kg-1，由此可以推測小鼠急性毒性實驗的LD50>4 g·kg-1。根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果分級，鵝脾混合多肽屬實際無毒物。

3 討論

多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中大多數(shù)具有一定的生物活性[9-10]。脾臟作為機體外周最大的免疫器官，與細胞免疫以及體液免疫均關(guān)系密切，20世紀七八十年代國內(nèi)外許多實驗室均開展有關(guān)動物脾臟來源的生物活性物質(zhì)的理化性質(zhì)及藥物活性的研究[11-12]。

天然多肽的分離純化方法要由所提取的組織材料及所要提取物質(zhì)的性質(zhì)決定。本實驗所采用的冷凍離心透析法具有快速簡便、采用相對分子質(zhì)量控制質(zhì)量等優(yōu)點，是提取混合多肽的較理想方法。經(jīng)上述方法獲得的多肽混合物通過氨基酸檢測儀及原子吸收儀進行成分鑒定，結(jié)果顯示該混合物含有甘氨酸、酪氨酸、組氨酸等氨基酸10余種，同時含有鋅、鈣等礦物元素6種。

機體抵抗病原微生物感染的免疫機制主要包括非特異性免疫和特異性免疫，其中非特異性免疫(亦稱固有免疫)是機體對抗病原微生物感染的第一道防線，其作用廣泛，無專一性，不僅能夠產(chǎn)生非特異抗感染免疫作用，而且在特異性免疫應(yīng)答過程中也起重要作用[13]。小鼠體內(nèi)淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及腹腔巨噬細胞吞噬功能則是最為常見的檢測非特異性免疫功能的指標，常用于評價藥物對細胞免疫功能的影響[6]。

在前期體外實驗中，筆者已經(jīng)采用可溶性淀粉/植物血凝素及刀豆素兩種淋巴細胞激活劑進行比較，實驗結(jié)果表明體外實驗中兩種激活劑結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義[14]。體內(nèi)實驗中，刀豆素鼠淋巴細胞激活作用較強，從而影響關(guān)于鵝脾多肽對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化作用結(jié)果的觀察，故本次體內(nèi)實驗中只用可溶性淀粉/植物血凝素做為淋巴細胞激活劑。

本研究結(jié)果表明，鵝脾混合多肽各劑量組均可以顯著提高小鼠體內(nèi)淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，并且在一定濃度范圍內(nèi)其轉(zhuǎn)化率與藥物濃度呈正相關(guān)，但過高濃度的鵝脾混合多肽對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化率則有抑制作用。巨噬細胞不僅參與機體的非特異性和特異性免疫反應(yīng)，而且是上述兩種免疫反應(yīng)聯(lián)系的“橋梁細胞”，在人體生理和病理過程中都發(fā)揮了重要作用[15]。

本實驗結(jié)果也表明，鵝脾混合多肽能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率。在一定限度內(nèi)該鵝脾混合多肽低、中劑量能顯著增強巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力，其吞噬能力隨著多肽濃度的升高而升高，這表明鵝脾混合多肽復(fù)方能增加巨噬細胞的免疫反應(yīng)，提高機體免疫力。

按照《中藥藥理實驗方法學(xué)》中成人量換算成動物劑量的倍數(shù)簡表換算[15]，本實驗所用最大藥物劑量約為人臨床擬用量的3 000倍，即直觀等效劑量為人的3 000倍(小鼠對藥物的耐受性為人的10倍)。本實驗條件下鵝脾混合多肽的MTD>4 g·kg-1。

綜上所述，本研究結(jié)果表明鵝脾混合多肽可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，顯著提高小鼠體內(nèi)淋巴細胞轉(zhuǎn)化率及腹腔巨噬細胞吞噬功能。其發(fā)生免疫調(diào)節(jié)作用的機制可能為本課題所采用的鵝脾混合多肽相對分子質(zhì)量<10 000的混合多肽具有易與細胞膜受體結(jié)合，因此具有提高細胞免疫識別功能的作用有關(guān)；需要指出的是鵝脾混合多肽中，除檢測到多種氨基酸外，同時含有鋅、鈣、鎂等金屬離子，因此該混合物也可能通過金屬離子通道進入細胞內(nèi)引起一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)；鵝脾混合多肽還可能具有激活和增強機體非特異性免疫功能的作用，能夠促進T淋巴細胞成熟并可使未致敏淋巴細胞激活成為致敏淋巴細胞，提高了淋巴細胞免疫功能，從而觸發(fā)和增強機體對感染的抵抗力；還可能誘生干擾素，直接阻止病毒蛋白質(zhì)的合成和復(fù)制，并能增強細胞表面抗原表達，促進自然殺傷細胞的細胞毒活性，調(diào)節(jié)淋巴細胞和巨噬細胞功能，可明顯改善機體細胞免疫功能。對于其吞噬功能及增強免疫機能的機制還有待進一步研究。

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Influence of Lienal Polypeptide of Goose on Mouse Nonspecific Immunity

TIAN Qiang1,FENG Xiangzhi2, YANG Limin3, ZHAO Pengwei3, YAO Xingyu2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory; 2.DepartmentofInternalMedicine,ManzhouliSouthernDistrictHospitalofInnerMongolia,Manzhouli021400,China; 3.DepartmentofMicrobiologyandImmunology,InnerMongoliaMedicalUniversity,Huhehot010059,China)

Objective To detect polypeptides with molecular weight less than 10 000 from the goose's spleen, and their influence on mouse lymphocyte transformation and phagocytosis of peritoneal macrophages. Methods The polypeptides with molecular weight less than 10 000 from the goose's spleen were obtained by refrigerated centrifugation dialysis method.The content of polypeptides was certified by ultraviolet spectrophotometer, amino acid detector and atomic absorption detector.The polypeptides were intramuscularly injected into Kunming mice at large, medium and small doses for 14 days.Mouse lymphocyte transformation and phagocytosis of peritoneal macrophages were observed. Results Polypeptides were obtained from the goose's spleen, pH=6.1, and content of micro-molecule polypeptide was 23.78 μg·mL-1.Component identification showed the polypeptides consisted of over 10 kinds of amino acids and 6 types of trace elements.In the three polypeptide dose groups, lymphocyte transformation and phagocytosis of peritoneal macrophages were significantly improved as compared with blank control group (P<0.05).In toxicity test, medium lethal concentration (LD50)was more than 4 g·kg-1. Conclusion Lienal polypeptides of goose can regulate and enhance mouse immunity obviously.

Lienal polypeptides of goose; Lymphocytes; Macrophages; Phagocytic function

2014-01-19

2014-06-03

*內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項目(2013MS11131)；滿洲里市科技項目(nmgmzl2013006)

田強(1969-)，男，山東濰坊人，主管檢驗師，學(xué)士，主要從事病原微生物及免疫學(xué)檢驗研究。電話：(0)13514700681，E-mail：524339234@qq.com。

姚星宇(1973-)，女，遼寧沈陽人，主任醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管的干細胞研究及神經(jīng)免疫學(xué)研究。電話：(0)18604819979，E-mail：2412602429@qq.com。

R392.5

A

1004-0781(2015)02-0158-04