褪黑素對大鼠坐骨神經(jīng)損傷延遲修復后神經(jīng)的保護作用

劉欣偉，柳云恩，張玉彪，周大鵬，趙 勇，項良碧，侯明曉

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院骨科，遼寧沈陽 110016;2沈陽軍區(qū)總醫(yī)院全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷實驗室，遼寧沈陽 110016

褪黑素對脊髓的保護作用逐漸被認識[1-4]，有學者通過在大鼠神經(jīng)損傷后即刻施加褪黑素干預來觀察其對脊髓損傷的保護作用并研究其機制。然而，在臨床工作中卻經(jīng)常會遇到一些無法在第一時間來院進行治療的神經(jīng)損傷患者，對于這部分進行神經(jīng)損傷延遲修復的患者，褪黑素的保護作用報道較少。本研究通過Masson染色及免疫組織化學方法觀察褪黑素對大鼠坐骨神經(jīng)損傷延遲修復后的神經(jīng)保護作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年雄性SD大鼠48只，體重205～235 g。由沈陽化工學院新藥安全評價中心動物部提供[許可證號:SYXK(遼)2006-0002]。

1.1.2 試劑及儀器 褪黑素(Melatonin，MT)，免疫組化染色試劑盒及一抗多克隆抗體(北京索來寶公司)。水合氯醛、無水乙醇及其他溶劑由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥學部提供。低溫冰箱(日本三洋公司)、電子天平及干燥箱(上海民橋科學精密儀器公司)、冰凍切片機(德國萊卡公司)、光學及倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、離心機(德國西格瑪公司)、Image Pro Plus圖像分析軟件(美國GE公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模和分組 將48只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組:延遲1 d修復組(n=12)、延遲1周修復組(n=12)、延遲1個月修復組(n=12)和延遲2個月修復組(n=12)。分別在坐骨神經(jīng)橫斷性損傷后1 d、1周、1個月及2個月后進行縫合修復。每組大鼠又隨機分為:實驗組(n=6)和對照組(n=6)。實驗組大鼠在神經(jīng)修復完成后立即給予褪黑素100 mg/kg溶于無水乙醇溶劑中，行腹腔注射，而對照組大鼠不給予褪黑素。

1.2.2 手術(shù)步驟 大鼠以水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后備皮，鉗夾皮膚沒有明顯痛覺反應后，顯露任意一側(cè)坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)分叉點近端1 cm處，使用鋒利刀片將坐骨神經(jīng)切斷。在制作神經(jīng)損傷延遲修復模型中，為防止神經(jīng)離斷后近端神經(jīng)自行長入遠端，將近端神經(jīng)埋入鄰近肌肉中，使用10-0縫線縫合肌肉和神經(jīng)。術(shù)畢，放入籠中飼養(yǎng)。各組大鼠分別在相應的時間點(1 d、1周、1個月、2個月)予以褪黑素藥物干預，然后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。5 d后處死大鼠，取斷端、近端和遠端神經(jīng)，放入液氮或4%多聚甲醛中等待后續(xù)處理。

1.2.3 Masson染色 取術(shù)后5 d的神經(jīng)標本制作石蠟切片。然后脫蠟至蒸餾水;Weigert鐵蘇木精染色5～10 min，蒸餾水稍沖洗;鹽酸乙醇分化液分化，蒸餾水沖洗數(shù)分鐘;稀氨水溶液返藍15 s，蒸餾水稍洗;麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水稍沖洗;1% 冰醋酸處理1 min;95%乙醇脫水多次;無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.4 免疫組織化學 取術(shù)后5 d的神經(jīng)標本制作石蠟切片，切面與神經(jīng)走行平行。然后脫蠟至蒸餾水。3%H2O2孵育10 min。PBS洗2～3遍后進行抗原修復。普通山羊血清封閉15 min，傾干后滴加兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)多抗(1：50)，4 ℃ 下孵育過夜。PBS洗3遍，滴加適量生物素標記工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗2～3遍后，加入辣根過氧化物酶聯(lián)羊抗兔IgG二抗孵育15 min。PBS洗3遍，DAB常溫下顯色5 min。PBS洗10 min后，蘇木精復染2 min，蒸餾水沖洗10～15 min。脫水，透明，封片，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 給予褪黑素5 d后觀察，4組大鼠無論是否給予褪黑素，都存在不同程度的足踝下垂以及行動不便。這種現(xiàn)象可能與恢復時間較短有關(guān)。

2.2 Masson染色 在延遲1 d修復組和延遲1周修復組中，對照組和實驗組大鼠的遠端坐骨神經(jīng)尚未發(fā)生組織崩解，幾近正常組織學形態(tài)，排列緊密，互相平行，軸突連續(xù)，軸突周圍圍繞著一層厚厚的淡紅色髓鞘，施萬細胞核深紅褐色，形態(tài)正常，神經(jīng)膜呈藍色。而在延遲1個月修復組和延遲2個月修復組中，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不存在，嚴重紊亂，大量變性、脫失的髓鞘以及大量溶解或裂解的施萬細胞核呈碎片狀。除此之外，膠原纖維大量充斥在崩解的神經(jīng)纖維組織之間，并且隨著延遲修復時間的延長，膠原纖維的比例越來越多，發(fā)生華勒氏變性的神經(jīng)細胞以及失神經(jīng)接觸的施萬細胞散落在膠原纖維之間。見圖1。

圖1 術(shù)后5 d各組大鼠坐骨神經(jīng)Masson染色

2.3 TGF-β抗體免疫組織化學染色 隨著延遲修復時間的延長，無論實驗組或?qū)φ战M，TGF-β抗體染色陽性細胞數(shù)越來越密，提示隨著延遲修復時間的延長，成纖維細胞不斷浸潤遠端神經(jīng)。該結(jié)果與Masson染色的結(jié)果一致，在神經(jīng)離斷后短期內(nèi)，成纖維細胞浸潤較少，膠原纖維的表達和合成較少。隨著時間的延長，組織中的成纖維細胞越來越多，因此，神經(jīng)組織中出現(xiàn)大量的膠原纖維。見圖2。

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)損傷后不僅會發(fā)生生理變化，而且往往伴隨著病理和細胞代謝的改變[5-8]。神經(jīng)生長速度緩慢，神經(jīng)斷端以遠的施萬細胞對再生神經(jīng)的支持隨著失神經(jīng)支配時間的延長會越來越弱。大鼠的坐骨神經(jīng)纖維需要大約1個月才能全部生長通過神經(jīng)縫合處[9-10]。學者們研究了褪黑素對神經(jīng)損傷的保護作用，發(fā)現(xiàn)褪黑素對大鼠的神經(jīng)損傷有明顯的保護作用，可以縮短軸突再生通過斷端的時間，利于神經(jīng)損傷的修復。

然而，這些實驗大多是在建立神經(jīng)損傷模型后立即給予褪黑素[11-12]。在臨床實際工作中，會有一部分患者由于各種條件限制，無法在受傷后第一時間就診，較早的手術(shù)治療在傷后12 h內(nèi)[13]，這對患者神經(jīng)損傷治療的預后造成了不利影響。本研究在前期實驗中觀察到坐骨神經(jīng)損傷后延遲修復時，褪黑素促進神經(jīng)再生不是持續(xù)有效的，褪黑素的有效期限為神經(jīng)損傷后1個月以內(nèi)。本研究中設(shè)計了神經(jīng)損傷延遲修復的藥物干預動物模型，以觀察褪黑素在這種情況下對坐骨神經(jīng)的保護作用。4組動物分別在神經(jīng)損傷后1 d、1周、1個月和2個月后給予修復。實驗組給予了褪黑素藥物干預，術(shù)后5 d觀察到所有動物術(shù)側(cè)后肢都存在不同程度的跛行現(xiàn)象，分析其原因可能與恢復時間較短有關(guān)。

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)TGF-β抗體免疫組織化學染色

Masson染色和TGF-β抗體的免疫組織化學染色結(jié)果提示，在延遲1 d和延遲1周修復組，無論是對照組還是實驗組，Masson染色中膠原纖維面積比例都不超過20%，隨著神經(jīng)損傷后修復時間的延遲，膠原纖維面積逐漸增大。在延遲1 d修復組和延遲1周修復組中，神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)尚存在，髓鞘飽滿，而膠原纖維很少;TGF-β染色的成纖維細胞的浸潤也相對較少。而從延遲1個月修復組開始，可以發(fā)現(xiàn)神經(jīng)完全崩解，連續(xù)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)被散落存在的施萬細胞以及膠原纖維所代替，TGF-β染色的成纖維細胞的密度較前兩組高。由于TGF-β可以調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，刺激多種細胞因子、炎癥介質(zhì)等活性物質(zhì)的合成和分泌及細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。因此，在組織纖維化中起重要作用，是目前已知的可以誘導多種組織纖維化的最具代表性的一種細胞因子[14-15]。在延遲1個月和延遲2個月修復組中，TGF-β免疫組織化學染色明顯強于延遲1 d和延遲1周修復組，表明隨著修復時間的延長，神經(jīng)遠端組織的纖維化程度明顯加重。這個現(xiàn)象提示，周圍神經(jīng)損傷1個月后，組織退變及神經(jīng)遠端組織的纖維化是神經(jīng)延遲修復后褪黑素不再能夠促進神經(jīng)再生的原因之一。

綜上所述，本研究認為，褪黑素對坐骨神經(jīng)損傷存在一定的保護作用，坐骨神經(jīng)損傷后延遲修復的時間對于褪黑素對坐骨神經(jīng)損傷的保護作用存在影響。

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